การสังเกตตัวอย่างทางชีวภาพโดย JEM-1400Flash ー การไหลจากการเตรียมตัวอย่างไปจนถึงการสังเกต ー

บทนำ

การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนช่วยให้สามารถสังเกตโครงสร้างจุลภาคในเซลล์ซึ่งไม่สามารถทำได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง เพื่อให้เข้าใจโครงสร้างโดยละเอียดของออร์แกเนลล์ เช่น ไมโทคอนเดรียและคลอโรพลาสต์ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนเป็นเครื่องมือที่ทรงพลัง อย่างไรก็ตาม ด้วย TEM การสังเกตของชิ้นงานทดสอบในสภาพมีชีวิตเป็นไปไม่ได้เนื่องจากการสังเกตจะดำเนินการในสุญญากาศ นอกจากนี้ ในการที่จะส่งลำอิเล็กตรอนได้ ชิ้นงานจะต้องถูกหั่นเป็นชิ้นบางๆ
เพื่อจุดประสงค์นี้ การเตรียมชิ้นงานทดสอบเป็นขั้นตอนที่สำคัญมากในการจับโครงสร้างของชิ้นงานโดยไม่มีสิ่งปลอมปน บันทึกการใช้งานนี้อธิบายการไหลของการเตรียมตัวอย่างสำหรับตัวอย่างทางชีวภาพ โดยใช้ตัวอย่างเนื้อเยื่อพืชเพื่อแนะนำข้อมูลที่ได้รับจาก JEM-1400Flash

การไหลของการเตรียมตัวอย่าง

มีหลายวิธีในการเตรียมตัวอย่างทางชีวภาพ ตัวอย่างเช่น เราได้แนะนำการตรึงชิ้นงานทดสอบโดยใช้วิธีการตรึงทางเคมีและวิธีการตัดเฉือนแบบบางเฉียบโดยใช้อุลตร้าไมโครโครโตม ขั้นตอนการเตรียมชิ้นงานทดสอบเป็นไปตามลำดับดังนี้ 1. การตัดชิ้นงานทดสอบ 2. การตรึง 3. การคายน้ำ 4. การทดแทน 5. การฝัง 6. การโพลิเมอไรเซชัน 7. การตัดแต่ง 8. การแบ่งส่วนแบบบางเฉียบ 9. การย้อมสี แต่ละขั้นตอนมีการอธิบายไว้ด้านล่าง

1. การตัดตัวอย่าง

ชิ้นงานทดสอบถูกตัดเป็นชิ้นเล็กๆ โดยใช้ใบมีดโกน เพื่อให้สารเคมีที่ใช้ในกระบวนการผลิตต่อไปซึมผ่านได้ง่าย

2. การตรึง

กระบวนการหยุดการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของตัวอย่างทางชีวภาพด้วยสิ่งประดิษฐ์เพียงไม่กี่ชิ้น สำหรับการตรึงด้วยสารเคมี การตรึงจะดำเนินการสองครั้ง: การตรึงล่วงหน้าและการตรึงภายหลัง คำนำหน้าใช้เพื่อตรึงโปรตีน และใช้หลังการตรึงเพื่อแก้ไขไขมัน
หมายเหตุ: Osmium tetroxide มีความผันผวนและมีปฏิกิริยาสูง และสามารถทำลายระบบทางเดินหายใจ ผิวหนัง และเยื่อเมือกของผู้ใช้ได้ ดังนั้น กระบวนการนี้ควรทำในอาหารที่มีควัน

รีเอเจนต์

• สารละลายนำหน้า：กลูตาราลดีไฮด์ 2.5 % และพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 2% ใน 0.1 M HEPES*¹ (ครึ่งคาร์นอฟสกี)
• สารละลายหลังการตรึง：สารละลายออสเมียมเตตรอกไซด์ 1 % (OsO₄ ใน 0.1 M HEPES)
• น้ำยาล้าง：0.1 M HEPES หรือน้ำกลั่น
• ขวดตัวอย่าง

^*1 HEPES: ตัวย่อของสารละลายบัฟเฟอร์ 2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid

3. การคายน้ำ

ใช้เอทานอลหรืออะซิโตนเพื่อทำให้ปริมาณน้ำในเซลล์ขาดน้ำ หากความชื้นยังคงอยู่ ปริมาณน้ำที่เหลืออยู่จะป้องกันไม่ให้เกิดพอลิเมอไรเซชันของเรซินในระหว่างการฝังเรซินในภายหลัง ปฏิบัติตามกระแสด้านล่างเพื่อแช่ตัวอย่างในความเข้มข้นของเอทานอลแต่ละชนิดเพื่อทดแทนปริมาณน้ำด้วยเอทานอล

4. การทดแทน

เมื่อถูกทำให้แห้งด้วยเอทานอล จะถูกแทนที่ด้วยโพรพิลีนออกไซด์ (PO) หรือคล้ายกันในฐานะสารตัวกลางเพื่อผสมกับอีพอกซีเรซิน

^*2 EPON 812：เรซิน, ^*3 ดีดีเอสเอ・^*4 MNA： ตัวชุบแข็ง, ^*5 DMP-30：สารเร่งความเร็ว

5. การฝัง

เพื่อเตรียมชิ้นส่วนที่บางเป็นพิเศษ จำเป็นต้องฝังชิ้นงานทดสอบในสารฝังแข็ง เช่น เรซิน
เรซินเหลวจะบ่มในระหว่างกระบวนการโพลิเมอไรเซชันในภายหลัง

เครื่องมือ

• อีพอกซีเรซิน
• แผ่นฝังซิลิโคน (รูปที่ 1)

• เทเรซิน
• วางชิ้นงานทดสอบไว้ที่ปลายแผ่นซิลิโคนฝังตัว
• ปล่อยให้นั่งสักครู่เพื่อผสมผสาน

รูปที่ 1 แผ่นฝังซิลิโคน

6. พอลิเมอไรเซชัน

อุ่นเรซินเพื่อรักษา เพื่อให้สามารถหั่นเรซินบางๆ ได้ วางแผ่นซิลิโคนฝังลงในเตาอบและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 60°C เป็นเวลาสามวัน การทำให้อุณหภูมิคงที่ในระหว่างการทำโพลิเมอไรเซชันสามารถป้องกันความล้มเหลวของโพลิเมอไรเซชันของเรซินได้

เครื่องมือ

• เตาอบสำหรับเรซินพอลิเมอไรเซชัน

7. การตัดแต่ง

ตัดชิ้นงานทดสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบออปติคัลเพื่อให้พื้นที่ที่จะสังเกตมีขนาดที่จะวางบนกริดของชิ้นงานทดสอบและกำหนดรูปร่างของพื้นผิวที่จะสังเกต

เครื่องมือ

• ใบมีดโกน
• กล้องจุลทรรศน์ออปติคอล

8. การแบ่งส่วนบางเฉียบ

นำเรซินออกเพื่อให้เห็นพื้นผิวของเนื้อเยื่อโดยใช้มีดแก้ว จากนั้นหั่นเป็นชิ้นบางพอที่จะส่งลำแสงอิเล็กตรอนด้วยมีดเพชรและ ultramicrotome แล้ววางบนตะแกรง

เครื่องมือ

• อัลตร้าไมโครโตม
• ตะแกรง
• มีดเพชร
• มีดแก้ว

• โพรบขนตา(รูปที่. 2)

รูปที่ 2 โพรบขนตา

9. การย้อมสี

การดำเนินการนี้ใช้เพื่อเพิ่มความคมชัดของตัวอย่างทางชีวภาพซึ่งมีธาตุแสงจำนวนมาก ความคมชัดของการกระเจิงเพิ่มขึ้นโดยการผูกองค์ประกอบหนักเข้ากับชิ้นงานทดสอบ เมื่อทำการย้อมส่วนที่บางเฉียบบนตะแกรง การย้อมสีสองครั้งจะดำเนินการโดยใช้ยูแรนิลอะซิเตตและตะกั่วซิเตรตเป็นสารย้อมสี Uranyl acetate คราบนิวคลีโอพลาสซึมและไรโบโซม ในขณะที่ตะกั่วซิเตรตเปื้อนเยื่อหุ้มเซลล์ เม็ดไกลโคเจน และไรโบโซม

รีเอเจนต์

• ยูเรนิลอะซิเตท^*6
• ตะกั่วซิเตรต

^*6 Uranyl acetate เป็นสารประกอบซึ่งเป็นสารควบคุมระดับสากลที่สามารถใช้ได้ในโรงงานที่ได้รับอนุญาตเท่านั้น
สารละลายทางเลือกสำหรับยูแรนิลอะซิเตต ได้แก่ อิตเทอร์เบียมอะซิเตท

ผล

รูปที่ 3 แสดงผลการสังเกตชิ้นงานแบบบางเฉียบที่เตรียมโดยปฏิบัติตามขั้นตอนข้างต้น โดยใช้ TEM (JEM-1400Flash)

รูปที่ 3 ภาพ TEM ของใบเมเปิ้ล
สามารถจับโครงสร้างเมมเบรนของออร์แกเนลล์ได้อย่างชัดเจน
ในภาพด้านซ้ายของรูปที่ 3 อุปกรณ์ Golgi สามารถมองเห็นได้ตรงกลางและคลอโรพลาสต์ทั้งสองด้าน
ภาพด้านขวาแสดงโครงสร้างของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย