การตรวจวัดโปรตีนที่มีความละเอียดสูงโดยใช้โหมดเกลียวของ JMS-S3000 "SpiralTOF™" [แอปพลิเคชัน MALDI]
MStips ฉบับที่ 297
บทนำ
JMS-S3000 “SpiralTOF™” เป็นเครื่องสเปกโตรมิเตอร์มวลสารแบบบอกเวลา (TOFMS) ที่ใช้การไอออไนเซชันของเลเซอร์ช่วยด้วยเมทริกซ์ (MALDI)
MALDI เป็นเทคนิคการแตกตัวเป็นไอออนแบบอ่อน ซึ่งโดยทั่วไปจะรักษาไอออนให้คงอยู่ในระหว่างการเกิดไอออน อย่างไรก็ตาม การแยกส่วนที่เกิดขึ้นเองภายหลังการแตกตัวเป็นไอออน ซึ่งเรียกว่าการสลายตัวภายหลังแหล่งที่มา (PSD) ก็เป็นที่ทราบกันดีเช่นกันว่าเกิดขึ้นระหว่างการวิเคราะห์ MALDI
โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เมื่อน้ำหนักโมเลกุลที่วิเคราะห์เพิ่มขึ้น เอฟเฟ็กต์ PSD จะเด่นชัดมากขึ้น ซึ่งทำให้แมสสเปกตรัมที่เกิดซับซ้อนขึ้น และลดสัญญาณที่วิเคราะห์โดยรวม SpiralTOF™ มีเส้นทางออปติคัลไอออนแบบพับ 17 ม. ซึ่งจะลดปริมาณไอออน PSD ที่ไปถึงเครื่องตรวจจับโดยอัตโนมัติ จึงลดความซับซ้อนของแมสสเปกตรัมให้เหลือน้อยที่สุด นอกจากนี้ การเลือกเมทริกซ์ที่เหมาะสมสามารถลด PSD ซึ่งจะทำให้สัญญาณของโปรตีนดีขึ้นได้
ในการศึกษานี้ เราใช้ JMS-S3000 เพื่อทดสอบเมทริกซ์หลายรายการสำหรับเอฟเฟกต์ PSD และวัดแมสสเปกตรัมที่มีความละเอียดสูงของอินซูลิน ubiquitin และไซโตโครมซีที่ไม่เสียหาย
การทดลอง
โปรตีน 10 ชนิด ได้แก่ อินซูลิน (1pmol/μl 100%TFA), ubiquitin (10pmol/μl water) และ cytochrome C (XNUMXpmol/μl water) - ถูกนำมาใช้สำหรับการทดลองเหล่านี้
ClCCA(4-chloro-α-cyanocinnamic acid) [1] ถูกละลายใน 70% acetonitrile/0.1%TFA (10 มก./มล.) นอกจากนี้ อินซูลินยังถูกวัดโดยใช้ CHCA (กรดα-cyano-4-ไฮดรอกซีซินนามิก) และ SA (กรดซินาพินิก) ซึ่งเป็นเมทริกซ์ที่ใช้กันทั่วไปสำหรับการวัดโปรตีน
สารละลายผสมของตัวอย่างและแต่ละเมทริกซ์ถูกพบบนแผ่นเป้าหมายและผึ่งลมให้แห้ง แมสสเปกตรัมได้มาจากโหมดไอออนบวก SpiralTOF และ LinearTOF
ผลสอบ
จากจุดเริ่มต้น มีการใช้โหมด LinearTOF เพื่อวัดอินซูลินด้วยเมทริกซ์แต่ละตัว (CHCA, SA และ ClCCA) ดังแสดงในรูปที่ 1
ในแต่ละกรณี [M+H]+ จุดสูงสุดแสดงอัตราส่วน S/N ที่ดีสำหรับเมทริกซ์ทั้งหมดเมื่อใช้เงื่อนไขการวัดที่เทียบเท่า ผลลัพธ์ LinearTOF เหล่านี้แสดงสถานะของไอออนทันทีหลังจากขอบเขตการเร่งความเร็ว ซึ่งโดยปกติแล้วเอฟเฟกต์ PSD จะไม่มีนัยสำคัญ
เฉพาะพีคสเปกตรัมมวลของ CHCA เท่านั้นที่แสดงรูปร่างพีคที่กว้างกว่าซึ่งบ่งชี้ถึงเอฟเฟกต์ PSD ที่ค่อนข้างใหญ่ จากนั้น จุดเหล่านี้ถูกวัดใหม่ในโหมด SpiralTOF และแมสสเปกตรัมที่ได้จะแสดงในรูปที่ 2
แมสสเปกตรัมสำหรับเมทริกซ์ทั้งหมดแสดง [M+H]+ พีคที่มีการแยกพีคไอโซโทปที่ดี อย่างไรก็ตาม สเปกตรัมมวลของ CHCA แสดงอัตราส่วน S/N ที่ต่ำกว่าแมสสเปกตรัมของ SA และ ClCCA ดังนั้นจึงสนับสนุนการสังเกตโหมด LinearTOF ว่ามีเอฟเฟกต์ PSD สูงกว่าสำหรับเมทริกซ์เฉพาะนี้ แมสสเปกตรัมทั้ง SA และ ClCCA แสดงค่าสูงสุดของอินซูลินที่มีอัตราส่วน S/N ที่ดีสำหรับสภาวะการวัดเดียวกัน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ค่าพีคของอินซูลิน ClCCA แสดงอัตราส่วน S/N ที่สูงกว่าเมทริกซ์อีก 2 ตัวอื่นมาก ซึ่งบ่งชี้ว่าเมทริกซ์นี้ดีกว่าสำหรับการลดผลกระทบของ PSD
รูปที่ 1 แมสสเปกตรัมของอินซูลินที่ได้มาโดยใช้โหมด LinearTOF ด้วยเงื่อนไขเมทริกซ์ (A) CHCA, (B) SA และ (C) ClCCA
รูปที่ 2 Mass spectra ของอินซูลินที่ได้มาโดยใช้โหมด SpiralTOF ด้วยเงื่อนไขเมทริกซ์ (A) CHCA, (B) SA และ (C) ClCCA
ถัดไป แมสสเปกตรัมของ ubiquitin และ cytochrome C ได้มาจากโหมด SpiralTOF โดยใช้ ClCCA (รูปที่ 3)
[M+H]+ สังเกตไอออนของโปรตีนทั้งสองที่มีอัตราส่วน S/N ที่ดี นอกจากนี้ พีคไอโซโทปของยูบิควินตินและไซโตโครมซีได้รับการแก้ไขอย่างดี และกำลังการแยกตัวโดยมวลสำหรับสารประกอบแต่ละชนิดอยู่ที่ประมาณ 48000 และ 36000 ตามลำดับ
รูปที่ 3 สเปกตรัมมวลของ ubiquitin (A) และ cytochrome C (B) ด้วยโหมด SpiralTOF โดยใช้ ClCCA
สรุป
SpiralTOF™ มีประสิทธิภาพสำหรับการวัดความละเอียดสูงของโปรตีนที่ไม่บุบสลาย การเลือกสารประกอบเมทริกซ์ที่เหมาะสม เช่น ClCCA สามารถช่วยลดผลกระทบของ PSD ซึ่งจะช่วยเพิ่มการวัดโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลมากกว่า 5000Da
อ้างอิง
[1] Jaskolla TW, Lehmann WD, Karas M. 4-Chloro-α-cyanocinnamic acid เป็นเมทริกซ์ MALDI ขั้นสูงที่ออกแบบอย่างมีเหตุผล Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:12200–12205.
- โปรดดูไฟล์ PDF สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม
หน้าต่างอื่นจะเปิดขึ้นเมื่อคุณคลิก 
PDF594KB
สินค้าที่เกี่ยวข้อง
คุณเป็นผู้เชี่ยวชาญทางการแพทย์หรือบุคลากรที่เกี่ยวข้องกับการรักษาพยาบาลหรือไม่?
ไม่
โปรดทราบว่าหน้าเหล่านี้ไม่ได้มีวัตถุประสงค์เพื่อให้ข้อมูลเกี่ยวกับผลิตภัณฑ์แก่ประชาชนทั่วไป