กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบใช้ความเย็นเผยให้เห็นความลึกลับของชีวิตโดยการตรวจสอบโครงสร้างโมเลกุลต่างๆ ใน "การแช่แข็งแบบลึก (Deep freeze)"
สัมภาษณ์ 07
เคอิจิ นัมบะ
ศาสตราจารย์ที่ Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University
โปรตีนประกอบขึ้นจากสิ่งมีชีวิตทั้งหมด และมีหน้าที่รับผิดชอบมากมาย เช่น ภูมิคุ้มกัน เมตาบอลิซึม การทำงานของสมอง และการเคลื่อนไหว ศาสตราจารย์เคอิจิ นัมบะ ผู้นำกลุ่ม Protonic NanoMachine ของ Graduate School of Frontier Biosciences ในมหาวิทยาลัยโอซาก้าสนใจกลไกที่โดดเด่นซึ่งอยู่ภายใต้หน้าที่เหล่านี้ และกำลังพยายามเปิดเผยความลับด้วยการศึกษาโครงสร้างสามมิติ (3D) ของโมเลกุลทางชีววิทยา .
การทำความเข้าใจฟังก์ชันจากโครงสร้าง
ร่างกายมนุษย์ประกอบด้วยโปรตีนต่างๆ ประมาณ 100,000 ชนิด แต่ละคนมีบทบาทเฉพาะตัว เช่น การสร้างเนื้อเยื่อของร่างกาย เร่งการเผาผลาญ การแลกเปลี่ยนสารอาหารผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ หรือทำลายสารแปลกปลอม หน้าที่เหล่านี้เป็นกิจกรรมที่สำคัญบางอย่างของร่างกายเรา
"โปรตีนเป็นเครื่องนาโนชนิดหนึ่งที่ทำงานภายในร่างกายที่มีชีวิต ฉันสนใจอย่างมากว่านาโนแมชชีนมีบทบาทอย่างไรและทำหน้าที่อย่างไร" ศาสตราจารย์นัมบะกล่าว กว่า 40 ปี ศาสตราจารย์ นัมบะได้ทำการวิจัยเกี่ยวกับการเปิดเผยหน้าที่ของโปรตีนจากโครงสร้างของพวกมัน
โปรตีนเป็นพอลิเมอร์เชิงเส้นของกรดอะมิโนหลายร้อยหรือหลายพันตัว มีกรดอะมิโนที่แตกต่างกันเพียง 20 ชนิดที่สร้างโปรตีน ยกเว้นกรดอะมิโนพิเศษบางชนิด ดังนั้น การรวมกันที่แตกต่างกันของกรดอะมิโนเหล่านี้ในลำดับที่ต่างกันทำให้เกิดโปรตีนที่แตกต่างกัน 100,000 ชนิด วลี "พอลิเมอร์เชิงเส้น" อาจคิดภาพของสายโซ่ยืดหยุ่น อย่างไรก็ตาม โครงสร้างแตกต่างอย่างสิ้นเชิงจากสายโซ่ที่โปรตีนแต่ละตัวมีโครงสร้าง 3 มิติที่แตกต่างกัน อันที่จริง กรดอะมิโนสายยาวถูกพับเป็นโครงสร้างที่ซับซ้อน และโครงสร้างเหล่านี้เหมือนกันในโปรตีนชนิดเดียวกัน โครงสร้างพับที่จุดเดียวกันทุกประการและในมุมเดียวกันทุกประการ อย่างไรก็ตาม การพับดังกล่าวอาจแตกต่างกันในบางครั้ง และที่น่าสนใจคือ โครงสร้างโมเลกุลเดียวกัน แต่ด้วยโครงสร้าง 3 มิติที่ต่างกัน สามารถแสดงคุณสมบัติที่แตกต่างกันโดยสิ้นเชิงและออกแรงทำหน้าที่ที่แตกต่างกัน ตัวอย่างเช่น แหล่งที่มาของปัญหา BSE ที่ก่อให้เกิดความตื่นตระหนกในอุตสาหกรรมอาหารในช่วงต้นทศวรรษ 2000 กล่าวกันว่าเป็นโปรตีนที่เรียกว่าพรีออน ไม่ใช่ทั้งไวรัสหรือสารเคมี น่าแปลกที่พรีออนมีถิ่นกำเนิดในสมองของมนุษย์และวัว พรีออนเหล่านี้แตกต่างจากอันผิดปกติที่ทำให้เกิด BSE เฉพาะในบางส่วนของโครงสร้าง 3 มิติเท่านั้น ดังนั้น เพื่อระบุหน้าที่ของโปรตีน ไม่เพียงแต่จำเป็นต้องเข้าใจโครงสร้างโมเลกุลของพวกมันโดยใช้อุปกรณ์และวิธีการวิเคราะห์เท่านั้น แต่ยังต้องสังเกตโครงสร้าง 3 มิติของพวกมันอย่างละเอียดด้วย
มอเตอร์โมเลกุลชีวภาพที่ซับซ้อน
ศาสตราจารย์นัมบะเป็นหนึ่งในผู้บุกเบิกการวิจัยโครงสร้างสามมิติของโมเลกุลทางชีววิทยา เขามีความสนใจเป็นพิเศษในกลุ่มโปรตีนที่เรียกว่ามอเตอร์โมเลกุล พวกมันถูกเรียกว่ามอเตอร์เพราะมันแสดงการเคลื่อนที่แบบหมุนหรือเชิงเส้นคล้ายกับมอเตอร์ที่มนุษย์สร้างขึ้น ตัวอย่างเช่น กล้ามเนื้อของมนุษย์ประกอบด้วย myofibrilla ซึ่งส่วนใหญ่ประกอบด้วยโปรตีนแอคตินและไมโอซินที่ประกอบกันในรูปแบบเส้นใย และการเคลื่อนที่เชิงเส้นของเส้นใยโปรตีนเหล่านี้ทำให้เกิดการหดตัวของกล้ามเนื้อ มอเตอร์แฟลเจลลาร์ที่มีลักษณะคล้ายมอเตอร์แบบหมุนที่มนุษย์สร้างขึ้นอย่างใกล้ชิดยิ่งขึ้นคือมอเตอร์แฟลเจลลาร์จากแบคทีเรีย ซึ่งหมุนเส้นใยยาวคล้ายเกลียวหางเรียกว่าแฟลเจลลัมเป็นใบพัดเพื่อขับเคลื่อนการเคลื่อนที่ของเซลล์แบคทีเรียในสภาพแวดล้อมที่มีความหนืด Escherichia coli และ Salmonella มีแฟลกเจลลาหลายตัว ได้แก่ รวมเข้าด้วยกันเพื่อสร้างแรงขับเหมือนสกรู อย่างไรก็ตาม โครงสร้างของมอเตอร์โมเลกุลนั้นยากต่อการมองเห็นมาเป็นเวลานาน
ศาสตราจารย์นัมบะเริ่มหมกมุ่นอยู่กับความลึกลับนี้และเริ่มการศึกษาวิจัยหลายชุดเพื่อเปิดเผยโครงสร้าง 3 มิติของมอเตอร์โมเลกุลเหล่านี้ มอเตอร์แฟลเจลลาร์ประกอบด้วยโปรตีนประมาณ 30 ชนิดที่สร้างโครงสร้างย่อย เช่น โรเตอร์ สเตเตอร์ และบุชชิ่ง และโครงสร้างนี้คล้ายกับมอเตอร์ไฟฟ้าทั่วไป เส้นใยกล้ามเนื้อทำมาจากการรวมกลุ่มของเส้นใยแอคตินและไมโอซินที่เชื่อมต่อกันเข้าด้วยกันเป็นโครงตาข่ายหกเหลี่ยมที่มีราคาสูง กล่าวกันว่ามอเตอร์อุตสาหกรรมเป็นหนึ่งในสิ่งประดิษฐ์ที่ยิ่งใหญ่ที่สุดของมนุษย์ แต่การค้นพบข้างต้นชี้ให้เห็นว่าแนวคิดนี้อาจเป็นข้อสันนิษฐานที่เย่อหยิ่ง
การเคลื่อนที่แบบประสานกันของมอเตอร์โมเลกุลเหล่านี้ต้องการพลังงาน แม้ว่าจะเป็นที่ทราบกันว่าไฮโดรเจนไอออนไหลผ่านช่องสเตเตอร์ของมอเตอร์แฟลเจลลาร์โดยการไล่ระดับศักย์ไฟฟ้าเคมีทั่วเยื่อหุ้มเซลล์และการไฮโดรไลซิสของ ATP โดยแอคโตไมโอซินเป็นแหล่งพลังงานสำหรับการหดตัวของกล้ามเนื้อ แต่ประสิทธิภาพพลังงานที่สูงของพวกมันนั้นลึกลับ เป็นที่ถกเถียงกันอยู่ว่าพลังงานของการเคลื่อนที่แบบบราวเนียนด้วยความร้อนอาจเกี่ยวข้อง แต่กลไกในการใช้นั้นไม่เป็นที่รู้จัก แหล่งความร้อนให้พลังงานสำหรับความผันผวนของอะตอมและโมเลกุล แต่เมื่อพิจารณาวัตถุที่ระดับอะตอม อะตอมและโมเลกุลจะเคลื่อนที่ไปในทิศทางใดก็ได้ด้วยความเร็วใดก็ได้
เชื่อกันว่าแม้แต่มอเตอร์ระดับโมเลกุลก็ไม่อาจสร้างแรงผลักดันในทิศทางใดทิศทางหนึ่งผ่านการเคลื่อนที่แบบสุ่มที่เกิดจากความร้อนของโมเลกุลและอะตอม กระนั้น แท้จริงแล้วพวกมันเคลื่อนไปในทิศทางเดียว ดังนั้นจึงมีกลไกที่แก้ไขการเคลื่อนที่แบบสุ่ม
ล่าสุด ศ.นัมบะ เข้าใกล้คำตอบมากขึ้นแล้ว เขาค้นพบว่าแอคโตไมโอซินในเส้นใยกล้ามเนื้อมีโครงสร้างเหมือนวงล้อที่ช่วยให้การเคลื่อนไหวที่ต้องการไปในทิศทางเดียว แต่ไม่ใช่ในอีกทางหนึ่ง ระบบที่ซับซ้อนดังกล่าวสร้างขึ้นจากโมเลกุลโปรตีนที่มีโครงสร้าง 3 มิติที่ไม่สมมาตรและไดนามิกอย่างชัดเจน
Cryomicroscopy เป็นพรมแดน
กล้องจุลทรรศน์ไครโออิเล็กตรอนของ JEOL "CRYO ARM™" ในห้องทดลองของศาสตราจารย์นัมบะ
การค้นพบดังกล่าวเกิดขึ้นได้จากการถ่ายภาพโดยละเอียดของโครงสร้าง 3 มิติของโปรตีนและสารเชิงซ้อน การวิเคราะห์โครงสร้างโดยผลึกเอ็กซ์เรย์เป็นวิธีหลักในการกำหนดโครงสร้างโปรตีน ในวิธีนี้ ตัวอย่างโปรตีนที่ตกผลึกจะถูกฉายรังสีด้วยรังสีเอกซ์ และวัดความเข้มของลำแสงที่เลี้ยวเบน ผลึกของโปรตีนเอ็กซ์เรย์มีมาตั้งแต่ปี 1950 และ 90% ของโครงสร้างโปรตีนที่รู้จักได้รับการแก้ไขโดยใช้วิธีนี้
อย่างไรก็ตาม วิธีนี้มีข้อเสียเปรียบที่สำคัญ: การตกผลึกเป็นข้อกำหนดเบื้องต้นสำหรับการวิเคราะห์แต่ไม่ใช่เรื่องง่าย นอกจากนี้ การตกผลึกมีแนวโน้มที่จะแก้ไขโครงสร้างโปรตีนในโครงสร้างที่เสถียรที่สุด แม้ว่าโมเลกุลมอเตอร์จะเปลี่ยนโครงสร้างอย่างมากในขณะที่ทำหน้าที่ของมัน แต่ก็สามารถตกผลึกได้เฉพาะในสภาวะที่เสถียรเท่านั้น กล่าวอีกนัยหนึ่งไม่สามารถสังเกตโครงสร้าง 3 มิติที่แตกต่างกันได้
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบใช้ความเย็นกำลังได้รับความสนใจเป็นวิธีหนึ่งในการเอาชนะข้อเสียเปรียบนี้ ไมโครสโคปแบบไครโอ-อิเล็กตรอนนั้นติดตั้งขั้นตัวอย่างที่เรียกว่า "ระยะไครโอ" ซึ่งช่วยให้สามารถเก็บอุณหภูมิกริดของตัวอย่างไว้ที่อุณหภูมิต่ำพิเศษได้ เช่น ระหว่าง -160°C ถึง −270°C โมเลกุลของโปรตีนในฟิล์มบางๆ ของสารละลายบนตะแกรงคาร์บอนที่มีรูพรุนจะถูกแช่แข็งในทันทีโดยใช้อีเทนเหลวเพื่อรักษาโครงสร้างสถานะ "มีชีวิต" การบันทึกภาพที่ฉายจากหลายทิศทางโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบเย็นช่วยให้โครงสร้าง 3 มิติของโปรตีนเหล่านี้สามารถจับภาพได้ในช่วงเวลาที่แน่นอนของการทำงาน นอกจากนี้ จำเป็นต้องแช่แข็งสารละลายตัวอย่างเพียงเล็กน้อยเท่านั้น และไม่จำเป็นต้องสำรวจเงื่อนไขการตกผลึกอีกจำนวนหนึ่ง
Prof. Namba มุ่งเน้นไปที่กล้องจุลทรรศน์ไครโออิเล็กตรอนและส่งเสริมการพัฒนาวิธีการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ไครโออิเล็กตรอนมากว่า 20 ปี การระบุกลไกการทำงานของแอคโตไมโอซินในเส้นใยกล้ามเนื้อเป็นความสำเร็จประการหนึ่งที่เกิดขึ้นได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์ไครโออิเล็กตรอน การเปิดเผยรายละเอียดของโครงสร้าง 3 มิติของแฟลเจลลาร์มอเตอร์ ซึ่งเป็นความฝันอันยาวนานของ ศ.นัมบะ กลับไม่ใช่ความฝันอีกต่อไป
"เหตุใดการกระทำของสารเล็กๆ เช่น โปรตีนจึงทำให้มองเห็นการเคลื่อนไหวของกล้ามเนื้อได้ นี่เป็นคำถามที่นำฉันไปสู่สาขาการวิจัยนี้ในสมัยเรียน ตอนนี้ฉันรู้สึกว่าฉันสามารถตอบคำถามได้ประมาณครึ่งหนึ่งแล้ว มีวันเหล่านั้น” ศาสตราจารย์นัมบะกล่าว
กล้องจุลทรรศน์ที่ดีที่สุดในโลก
Prof. Kato (ซ้าย) และ Prof. Namba ปฏิบัติการ CRYO ARM™ จากอีกห้องหนึ่ง
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบใช้ความเย็นล่าช้ากว่าการวิเคราะห์โครงสร้างเอ็กซ์เรย์มาเป็นเวลานาน เนื่องจากมีความละเอียดไม่เพียงพอของอดีต กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนจะฉายรังสีตัวอย่างด้วยลำแสงอิเล็กตรอนที่รุนแรง อิเล็กตรอนจะกระจัดกระจายอยู่ในตัวอย่าง และเลนส์จะสร้างภาพตัวอย่างตามการกระเจิงของอิเล็กตรอน อย่างไรก็ตาม เนื่องจากโมเลกุลทางชีววิทยาเสียหายได้ง่ายจากลำอิเล็กตรอน ความเข้มของลำแสงจึงต้องถูกลดทอนลงอย่างมากโดยใช้เทคนิคขนาดต่ำเพื่อหลีกเลี่ยงความเสียหายจากรังสี เราสามารถเห็นภาพที่พร่ามัวและมีสัญญาณรบกวนได้เหมือนกับเวลาที่มีเพียงหลอดไฟดวงเล็กๆ ในห้องมืด
อย่างไรก็ตาม ความพยายามอันยาวนานในการพัฒนาเทคโนโลยีได้ช่วยให้เราเอาชนะปัญหานี้ได้ ในแง่ของฮาร์ดแวร์ กล้องได้รับการปรับปรุงอย่างมาก กล้อง CCD แบบธรรมดาจะแปลงอิเล็กตรอนที่กระจัดกระจายเป็นแสงก่อนสร้างภาพ และจะมีการสร้างและขยายสัญญาณรบกวนประเภทต่างๆ ในกระบวนการนี้ ดังนั้นจึงไม่สามารถปรับปรุงประสิทธิภาพการตรวจจับได้ อย่างไรก็ตาม การเกิดขึ้นของกล้อง CMOS ที่สามารถตรวจจับอิเล็กตรอนโดยตรงเพื่อบันทึกภาพ ได้ปรับปรุงทั้งความไวและความละเอียด และยังช่วยให้แก้ไขการเคลื่อนที่ของชิ้นงานทดสอบด้วยการถ่ายภาพอัตราเฟรมสูงได้ ดังนั้น คุณภาพของภาพที่ได้รับการปรับปรุงอย่างมากสามารถทำได้โดยใช้กล้องเหล่านี้
ซอฟต์แวร์ประมวลผลภาพก็มีความก้าวหน้าที่โดดเด่นเช่นกัน ด้วยซอฟต์แวร์ในปัจจุบัน สามารถรับภาพฉายภาพของโมเลกุลโปรตีนหลายแสนภาพในทิศทางที่ต่างกันได้อย่างง่ายดายด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบแช่แข็ง การคาดคะเนเหล่านี้ถูกจำแนกออกเป็นกลุ่มๆ โดยที่แต่ละกลุ่มมีการคาดการณ์ในทิศทางเดียวกัน ภาพของคลาสเดียวกันสามารถซ้อนทับเพื่อปรับปรุงอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน ซึ่งช่วยให้สามารถสังเกตรายละเอียดที่มีความละเอียดสูงได้ ในขั้นตอนสุดท้าย ค่าเฉลี่ยของชั้นเรียนจำนวนมากจะรวมเข้ากับโครงสร้าง 3 มิติ การประมวลผลข้อมูลที่ซับซ้อนดังกล่าวเกิดขึ้นได้ในระดับห้องปฏิบัติการ เนื่องจากความสามารถในการประมวลผลขั้นสูงของคอมพิวเตอร์สมัยใหม่
CRYO ARM™ ที่เปิดตัวในห้องปฏิบัติการของ Prof. Namba ได้รับการออกแบบมาเพื่อตอบสนองความต้องการของเขาสำหรับ "กล้องจุลทรรศน์ที่ดีที่สุดในโลก" เป้าหมายการออกแบบคือเพื่อให้สามารถวิเคราะห์โครงสร้างที่ความละเอียดดีกว่า 2.0 Å (1 Å หรือ angstrom เทียบเท่า 0.1 นาโนเมตร) ซึ่งดีกว่าผลึกศาสตร์เอ็กซ์เรย์มาตรฐาน นอกจากนี้ ยังสามารถโหลดตารางตัวอย่างหลายตารางลงใน CRYOARM™ และเปลี่ยนไปยังขั้นตอนของตัวอย่างโดยอัตโนมัติได้ทุกเมื่อเพื่อความสะดวกของผู้ใช้ การใช้เวลาลดลงอย่างมากในการเก็บรวบรวมและวิเคราะห์ข้อมูลภาพเป็นหนึ่งในข้อดีที่สุดของกล้องจุลทรรศน์นี้ การวิเคราะห์โครงสร้าง 3 มิติที่เคยใช้เวลาหนึ่งปีเมื่อ 5 หรือ 6 ปีที่แล้วสามารถทำได้ภายในหนึ่งสัปดาห์
ความก้าวหน้ารอบมุม
ศ.นัมบะเชื่อว่าโครงสร้าง 3 มิติของโปรตีนไม่เพียงเท่านั้น แต่ยังรวมถึงสารเชิงซ้อนทางชีวโมเลกุลอื่นๆ ซึ่งรวมถึงลิปิดและกรดนิวคลีอิกด้วย จะแสดงให้เห็นใน 5 ปี
การประยุกต์ใช้ที่สำคัญอย่างยิ่งคือการวิเคราะห์โปรตีนเมมเบรนบนผิวเซลล์ โปรตีนเหล่านี้เป็นเป้าหมายของการกระทำของรีเอเจนต์ทางเภสัชกรรม และการวิเคราะห์โครงสร้าง 3 มิติของพวกมันจะช่วยเปิดเผยกลไกที่อยู่เบื้องหลังการทำงานของโมเลกุล ปรับปรุงผลการรักษาอย่างมาก และทำให้การพัฒนายาเป็นไปได้โดยไม่มีผลข้างเคียง
ในอนาคต อาจมีการเคลื่อนไหวไปสู่การใช้งานทางอุตสาหกรรมของมอเตอร์โมเลกุลชีวภาพ เช่น เครื่องจักรที่ประหยัดพลังงานมากซึ่งต้องการแหล่งพลังงานน้อยที่สุด และทำงานโดยใช้ความร้อนแวดล้อมเป็นแหล่งพลังงานหลัก แนวความคิดที่ขัดแย้งนี้สามารถท้าทายความเชื่อที่มีมาช้านานเกี่ยวกับเครื่องจักรและวิศวกรรม
แม้ว่าเราจะยังห่างไกลจากการตระหนักถึงสิ่งประดิษฐ์ดังกล่าว แต่การตระหนักรู้ของพวกเขาอาจพิสูจน์ได้ว่าอยู่ใกล้แค่เอื้อม
β-galactosidase 2.6 Å ความละเอียด CRYO ARM™
ตัวอย่าง:
เบต้า-กาแลคโตซิเดสกับ PETGกล้องจุลทรรศน์:
CRYO ARM™ (Schottky 200 kV) / การประชุมสุดยอด K2จำนวนภาพ:
2,500 ใน 3 วัน โดย JADASขนาดพิกเซลของภาพ:
0.8 Å/พิกเซลจำนวนภาพอนุภาค:
350,000 (รถกระบะครั้งแรก), 88,564 (สำหรับการสร้าง 3D ขั้นสุดท้าย)ซอฟต์แวร์:
Motioncor2, Gctf, Gautomatch, Relion2.0ปริมาณทั้งหมด:
70 e-/Å2 (70 เฟรม (0.2 วินาที/เฟรม x 14 วินาที)
ข้อมูล: เอื้อเฟื้อโดย Dr. T. Kato and Dr. K. Namba, Osaka University, สิงหาคม 2017
เคอิจิ นัมบะ
ศาสตราจารย์ที่ Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University
หลังจากจบหลักสูตรปริญญาเอกที่ Graduate School of Engineering Science, Osaka University เขาได้รับแต่งตั้งให้เป็น Research Fellow of the Japan Society for the Promotion of Science, Research Associate จากสองมหาวิทยาลัยในสหรัฐอเมริกา และ Group Leader of the Research Development Corporation of ประเทศญี่ปุ่น (สำนักงานวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศญี่ปุ่นในปัจจุบัน) จากนั้นเขาก็เข้ารับตำแหน่งผู้อำนวยการฝ่ายวิจัยที่สถาบันระหว่างประเทศเพื่อการวิจัยขั้นสูงของ Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. ในปี 1992 เขาดำรงตำแหน่งปัจจุบันมาตั้งแต่ปี 2002 เขามีความเชี่ยวชาญในด้านชีวฟิสิกส์และการวิเคราะห์ ของโครงสร้างและหน้าที่ของสารเชิงซ้อนทางชีวโมเลกุล เช่น มอเตอร์โมเลกุล
โพสต์:ตุลาคม 2017