เครื่องลิควิดโครมาโตกราฟีแมสสเปกโตรมิเตอร์
เครื่องลิควิดโครมาโตกราฟีแมสสเปกโตรมิเตอร์
Liquid chromatograph mass spectrometer (LC/MS) เป็นอุปกรณ์ที่เป็นการรวมกันระหว่าง liquid chromatograph (LC) และแมสสเปกโตรมิเตอร์ (MS) LC/MS ถูกใช้ในหลายพื้นที่
แมสสเปกโตรมิเตอร์แก๊สโครมาโตกราฟี (GC/MS) เป็นเครื่องมือวิเคราะห์สำหรับสารระเหย ในการเปรียบเทียบ LC/MS ถูกใช้เป็นเครื่องมือสำหรับวัสดุหลายประเภท ตั้งแต่สารระเหยไปจนถึงสารทนไฟ
เมื่อเร็วๆ นี้ แนวโน้มในการวิเคราะห์ด้วยโครมาโตกราฟีได้เปลี่ยนจากแก๊สโครมาโตกราฟี (GC) เป็นโครมาโตกราฟีของเหลว (LC) เหตุผลก็คือสำหรับสารระเหยง่าย สามารถใช้ GC ได้ แต่สำหรับสารทนไฟ GC จะไม่สามารถใช้ได้ เว้นแต่จะมีการบำบัดทางเคมีบางอย่าง เช่น การทำให้เป็นอนุพันธ์ เพื่อทำให้สารทนไฟระเหยได้ ในทางกลับกัน เมื่อใช้ LC ไม่จำเป็นต้องสร้างอนุพันธ์ และพื้นที่ตัวอย่างเป้าหมายสามารถกว้างกว่าพื้นที่ที่ใช้กับ GC ได้มาก อย่างไรก็ตาม ในกรณีของ LC มีบางแง่มุมของตัวตรวจจับที่สร้างความยุ่งยาก ดังนั้นต้องทำการเลือกให้สอดคล้องกับตัวอย่างและคุณลักษณะ แต่การใช้ MS เป็นเครื่องตรวจจับมีศักยภาพสำหรับความเก่งกาจที่มากขึ้นและความแม่นยำในการระบุตัวตนที่ดีขึ้น นอกจากนี้ ลักษณะที่ปรากฏของอินเทอร์เฟซเพื่อเชื่อมต่อ LC และ MS อย่างมีประสิทธิภาพ ตลอดจนการปรับปรุงประสิทธิภาพได้นำไปสู่ความต้องการที่เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วสำหรับ LC/MS
อินเทอร์เฟซ LC/MS
นับตั้งแต่ทศวรรษ 1970 เป็นต้นมา อินเทอร์เฟซสำหรับ LC/MS เป็นหัวข้อของการศึกษาที่เข้มข้น และมีการเสนอและดำเนินการวิธีการที่หลากหลาย ในบรรดาวิธีดังกล่าว ได้แก่ วิธีการของสายพาน ซึ่งเฟสเคลื่อนที่จาก LC ถูกหย่อนลงบนสายพาน ให้ความร้อนแล้ววัดโดยใช้วิธีอิเล็กตรอนไอออไนซ์ (EI) วิธีการฉีดพ่น โดยตัวอย่างถูกพ่นเป็นละอองแก๊สและแตกตัวเป็นไอออนโดยใช้วิธี EI และวิธีการพ่นด้วยความร้อน ในช่วงปลายทศวรรษ 1980 วิธีการไอออไนซ์ความดันบรรยากาศ (API) ปรากฏขึ้นและมีการใช้กันอย่างแพร่หลาย เป็นอินเทอร์เฟซ LC/MS มาตรฐานในปัจจุบัน ในขณะที่ LC สามารถใช้ของเหลวที่ความดันบรรยากาศเป็นเฟสเคลื่อนที่ได้ MS ต้องใช้สุญญากาศสูง อินเทอร์เฟซที่รวมลักษณะที่ขัดแย้งกันของสิ่งเหล่านี้ได้สำเร็จคือวิธีการไอออไนซ์ความดันบรรยากาศ ”วิธี API” วิธีการแตกตัวเป็นไอออนสำหรับ API มีสองแบบ วิธีแรกคือวิธีพ่นไอออนด้วยไฟฟ้า (ESI) และอีกวิธีหนึ่งคือวิธีสร้างประจุไอออนเคมีด้วยความดันบรรยากาศ (APCI)
1) วิธี ESI
นี่เป็นวิธีการไอออไนเซชันซึ่งนำสารละลายเฟสเคลื่อนที่เข้าไปในเส้นเลือดฝอย และใช้ไฟฟ้าแรงสูงระหว่างเส้นเลือดฝอยนี้กับอิเล็กโทรดที่อยู่ตรงข้าม
คุณสมบัติของวิธีนี้คือพลังงานไอออไนเซชันนั้นเล็กที่สุดในบรรดาวิธีการไอออไนซ์ที่มีอยู่ ด้วยเหตุนี้ นี่เป็นวิธีเดียวที่สามารถรับข้อมูลน้ำหนักโมเลกุลของตัวอย่างพอลิเมอร์ทางชีววิทยาไม่เพียงเท่านั้น แต่ยังประสานสารประกอบพันธะ เช่น สารเชิงซ้อนเชิงประสานงาน นอกจากนี้ เมื่อวิธีนี้ใช้กับโปรตีน เปปไทด์ หรือกรดนิวคลีอิก จะทำให้สามารถสังเกตได้ในรูปของไอออนหลายวาเลนต์
ตัวอย่างเช่น เมื่อสังเกตสารประกอบที่มีน้ำหนักโมเลกุล 10,000 เป็นไอออน +10 วาเลนซ์ ค่า m/z (อัตราส่วนมวล/ประจุ) ของสเปกตรัมมวลที่ได้รับจะกลายเป็น 1,001 สเปกตรัมของไอออนที่มีหลายวาเลนต์สามารถรับได้ในลักษณะสเปกตรัมที่มีการกระจาย และช่วยให้สามารถคำนวณน้ำหนักโมเลกุลได้อย่างแม่นยำโดยใช้คอมพิวเตอร์
สเปกตรัมไอออนแบบหลายวาเลนต์ของแอนติบอดี ESI IgG2b (ประมาณ 150,000 MW) และผลการคำนวณน้ำหนักโมเลกุล
2) วิธี APCI
ดังที่สามารถอนุมานได้จากชื่อ "ไอออไนเซชันเคมีด้วยความดันบรรยากาศ" นี่เป็นวิธีการใช้ตัวทำละลายเฟสเคลื่อนที่เพื่อเติมบทบาทที่คล้ายคลึงกันกับก๊าซรีเอเจนต์ในการไอออไนซ์ทางเคมีเพื่อวัดไอออนของโมเลกุลด้วยโปรตอนและไอออนที่เติมด้วยตัวทำละลายเฟสเคลื่อนที่ เพิ่ม การแตกตัวเป็นไอออนทำได้โดยการใส่ละอองลอยของสารละลายตัวอย่างลงในพื้นที่ปล่อยโคโรนา ตัวอย่างเป้าหมายเป็นสารประกอบที่มีขั้วต่ำกว่าที่เหมาะสมสำหรับ ESI
นอกจากนี้ ในการทำไอออไนซ์ทางเคมี ความเข้มข้นของตัวทำละลายในเฟสเคลื่อนที่ต้องสูง ดังนั้นจะใช้อัตราการไหล 1 มล. หรือมากกว่าต่อนาที
ตัวอย่างการวิเคราะห์โดยใช้วิธี APCI แสดงไว้ด้านล่าง ตัวอย่างเป้าหมายคือชาเขียว ชาเขียวมีคาเทชินจำนวนมาก ซึ่งมีชื่อเสียงในด้านผลกระทบที่หลากหลาย รวมถึงฤทธิ์ต้านแบคทีเรีย ผลการวัดของชาเขียวธรรมดา 20 ไมโครลิตรที่ฉีดเข้าไปใน LC มีดังต่อไปนี้
ผลการวัดแสดงให้เห็นชัดเจนว่าชาเขียวประกอบด้วยกรดอะมิโน คาเทชิน คาเฟอีน และรูตินจำนวนมาก
ตัวอย่างการวัด APCI-LC/MS ของชาเขียว
(EC:epicatechin, EGC: epigallocatechin, ECg:epicatechinallate, EGCg: epigallocathechingallate)
ตามที่แสดงให้เห็น LC/MS สามารถวิเคราะห์ส่วนประกอบของตัวอย่างได้หลากหลายตั้งแต่โพลิเมอร์ชีวภาพไปจนถึงชาเขียว อย่างง่ายดายและมีความไวสูง