การวิเคราะห์สารเมตาบอไลต์ในสาเกแบบไม่กำหนดเป้าหมายโดยใช้แก๊สโครมาโตกราฟี - เครื่องสเปกโตรมิเตอร์มวลตามเวลาการบิน (GC-TOFMS)

บทนำ

สาเกเป็นเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ของญี่ปุ่นที่ทำจากข้าว โคเมะโคจิ และน้ำเป็นหลัก นอกจากแอลกอฮอล์แล้ว สาเกยังมีกรดอะมิโน กรดอินทรีย์ และน้ำตาล ซึ่งให้รสชาติและรสชาติที่หลากหลาย สาเกยังจัดอยู่ในประเภท 'Daiginjo-shu', 'Junmai-shu' และ 'Honjozo-shu' ขึ้นอยู่กับอัตราส่วนการขัดข้าวและการเติมแอลกอฮอล์กลั่นหรือไม่ และสาเกประเภทอื่น ๆ จัดเป็น 'futsu-shu' '¹⁾- กรดอะมิโน กรดอินทรีย์ และน้ำตาลในสาเกคิดว่ามีต้นกำเนิดมาจากการเผาผลาญของจุลินทรีย์ เช่น โคเมะโคจิและยีสต์ ดังนั้นจึงอาจเป็นไปได้ที่จะจำแนกประเภทของสาเกเหล่านี้โดยการวิเคราะห์ทางเมแทบอลิซึม
แก๊สโครมาโตกราฟี-แมสสเปกโตรมิเตอร์ (GC-MS) ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับเมแทบอลิซึม เนื่องจากมีฐานข้อมูลที่สมบูรณ์ ใช้งานง่าย และมีความสามารถในการทำซ้ำในการวัดสูง เป้าหมายการตรวจวัดของ GC-MS คือสารประกอบระเหย อย่างไรก็ตาม สามารถใช้กระบวนการอนุพันธ์ เช่น ไตรเมทิลไซลิเลชัน เพื่อตรวจวัดสารที่มีขั้วสูง เช่น น้ำตาลและกรดอะมิโน นอกจากนี้ ในด้านเมแทบอลิซึม บางครั้งอาจตรวจพบ "สารประกอบที่ไม่รู้จัก" ที่ไม่ได้ลงทะเบียนในฐานข้อมูลไลบรารี (DB) ในกรณีนี้ สามารถกำหนดสูตรโมเลกุลของสารประกอบที่ไม่รู้จักได้โดยใช้แมสสเปกโตรมิเตอร์ตามเวลาการบิน (TOFMS) เป็นแมสสเปกโตรมิเตอร์ และดำเนินการ "การวิเคราะห์เชิงบูรณาการ" ที่รวมอิเล็กตรอนไอออไนเซชันและไอออนไนซ์แบบอ่อน²⁾- นอกจากนี้ ด้วยการใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์โครงสร้างอัตโนมัติชื่อ “msFineAnalysis AI” ซึ่งใช้ปัญญาประดิษฐ์ (AI) เพื่อทำนายสเปกตรัมมวล EI จากโครงสร้างทางเคมี ทำให้สามารถประมาณสูตรโครงสร้างได้³⁾.
ใน MSTip นี้ เราจะรายงานผลลัพธ์ของการวิเคราะห์สารเมตาบอไลท์ในสาเกแบบไม่มีเป้าหมายโดยใช้แก๊สโครมาโตกราฟีตามเวลาการบินแมสสเปกโตรเมตรี (GC-TOFMS)

การทดลอง

อนุพันธ์

มีการใช้สาเกสี่ประเภทที่มีการจำแนกเชิงพาณิชย์ที่แตกต่างกัน (Daiginjo-shu, Junmai-shu, Honjozo-shu และ Nigori-shu) ถูกนำมาใช้เป็นตัวอย่าง เกี่ยวกับนิโกริ-ชู มันถูกปั่นเหวี่ยง (4 ℃, 10 นาที, 12,000 รอบต่อนาที) และใช้เฉพาะส่วนลอยเหนือตะกอนเป็นตัวอย่าง นอกจากนี้เรายังได้เตรียมตัวอย่างการตรวจสอบคุณภาพ (QC) โดยผสมตัวอย่างทั้งหมดในปริมาณที่เท่ากัน ไปยัง 20 µL ของแต่ละตัวอย่าง สารละลายเมทานอลของกรดซินาปิก 10 มก./มล. 1 µL ถูกเติมเป็นมาตรฐานภายในและผสม จากนั้นนำไปทำให้แห้งในเครื่องระเหยและทิ้งไว้ข้ามคืนในเครื่องดูดความชื้น วันถัดไป, สารละลายเมทอกซีเอมีน ไฮโดรคลอไรด์ ไพริดีน 100 มก./มล. 20 ไมโครลิตรถูกเติมลงในแต่ละตัวอย่างและเขย่าด้วยเทอร์โมเชคเกอร์ (30 ℃, 90 นาที, 1200 รอบต่อนาที) หลังจากนั้น 50 ไมโครลิตรของ N-เมทิล-N-(ไตรเมทิลไซลิล)ไตรฟลูออโรแอซีทาไมด์ (MSTFA) ถูกเติม และของผสมถูกให้ความร้อนและเขย่าด้วยเทอร์โมเชคเกอร์อีกครั้ง (37 ℃, 30 นาที, 1200 รอบต่อนาที)

การวัด GC-MS

มีการใช้ GC-TOFMS (JMS-T2000GC AccuTOF™ GC-Alpha, JEOL Ltd.) สำหรับการวัด เราใช้ทั้งโหมด EI และโหมดไอออไนซ์ภาคสนาม (FI) โดยมีแหล่งกำเนิดไอออน EI/FI/FD รวมกัน สำหรับแต่ละตัวอย่าง การวัด n=3 ดำเนินการโดยใช้ EI และการวัด n=1 ดำเนินการโดยใช้ FI เงื่อนไขรายละเอียดอื่น ๆ แสดงไว้ในตารางที่ 1

การประมวลผลข้อมูล

ข้อมูล EI ถูกแปลงเป็นรูปแบบทั่วไปของ GC-MS netCDF ข้อมูลเหล่านี้ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้โปรแกรมวิเคราะห์เมแทบอลิก MS-DIAL (เวอร์ชัน 4.9, RIKEN) เพื่อตรวจจับพีคและระบุสารประกอบ สำหรับการระบุสารประกอบ msFineAnalysis AI (JEOL Ltd.) ซึ่งสามารถผสานรวมและวิเคราะห์ข้อมูล EI และ FI ได้ถูกนำมาใช้เพื่อระบุจุดสูงสุดด้วยความแม่นยำสูงกว่า และป้องกันการระบุผิดพลาด หลังจากการระบุสารประกอบ เราได้ทำให้แต่ละพีคเป็นมาตรฐานตามมาตรฐานภายในและ LOWESS และความเข้มพีคของแต่ละตัวอย่างถูกส่งออก จากนั้นทำการวิเคราะห์หลายตัวแปรใน MetaboAnalyst 6.0 ⁴⁾- สำหรับการวิเคราะห์หลายตัวแปร การวิเคราะห์องค์ประกอบหลักและการวิเคราะห์คลัสเตอร์แบบลำดับชั้นได้รับการดำเนินการหลังจากการทำให้เป็นมาตรฐานด้วย AutoScaling

ตารางที่ 1 เงื่อนไขการวัด GC-MS

ผลลัพธ์และการสนทนา

ผลการเปรียบเทียบ TICC

รูปที่ 1 แสดง TICC ของข้อมูล EI ตรวจพบสารประกอบหลายชนิดที่จำเพาะต่อสาเกในแต่ละตัวอย่าง รวมถึงน้ำตาลแอลกอฮอล์ เช่น กลีเซอรอลและกลีเซอรีลกลูโคไซด์ น้ำตาล เช่น กลูโคส กรดอะมิโน กรดอินทรีย์ เนื่องจากความเข้มข้นสูงสุดของแต่ละส่วนประกอบแตกต่างกันไปในแต่ละตัวอย่าง การวิเคราะห์หลายตัวแปรจึงถูกดำเนินการ

*:ภายนอก ม./ซ สอบเทียบ

รูปที่ 1 TICC ของสารเมตาบอไลต์ในสาเก

การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก

รูปที่ 2 แสดงผลการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) ที่ดำเนินการโดย MetaboAnalyst บนข้อมูลที่ปรับให้เป็นมาตรฐานโดย LOWESS และมาตรฐานภายใน แผนภาพคะแนนในรูปที่ 2-A แสดงให้เห็นว่าคะแนนบวกและลบขององค์ประกอบหลักแรก (PC1) สามารถจำแนก Junmai-shu และองค์ประกอบอื่นๆ ได้ สิ่งนี้อาจบ่งบอกถึงความแตกต่างเนื่องจากการเติมแอลกอฮอล์กลั่นในระหว่างการผลิตสาเกหรือไม่ นอกจากนี้ ยังสามารถจำแนก Daiginjo-shu และอื่นๆ ตามคะแนนบวกและลบขององค์ประกอบหลักที่สอง (PC2) สันนิษฐานว่าเกิดจากความแตกต่างของอัตราการขัดข้าว โปรดทราบว่าการจำแนกประเภทของ Nigori-shu ไม่ได้เขียนไว้บนขวด อย่างไรก็ตาม Nigori-shu ถูกวางแผนใกล้กับ Honjozo-shu และอาจมีลักษณะคล้ายกัน

รูปที่ 2 ผลการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (A) พล็อตคะแนน (B) กำลังโหลดพล็อต

ผลลัพธ์การวิเคราะห์คลัสเตอร์แบบลำดับชั้น (HCA)

แผนที่ความร้อนของผลลัพธ์การวิเคราะห์คลัสเตอร์แบบลำดับชั้น (HCA) จะแสดงอยู่ในรูปที่ 3 แผนที่ความร้อนแสดงความอุดมสมบูรณ์ของแต่ละองค์ประกอบตามสี (แดง: สูง น้ำเงิน: ต่ำ) ทำให้สามารถเห็นภาพลักษณะเฉพาะของสารประกอบแต่ละชนิดได้ ตัวอย่าง. ตัวอย่างเช่น ผลการเปรียบเทียบความเข้มสูงสุดของคุณลักษณะของสารประกอบโพรลีนและวาลีนในจุนไมชูแสดงในรูปที่ 4 กรดอะมิโนโพรลีนและวาลีนเป็นส่วนประกอบของความขมของสาเก5) จุนไมชูทำจากข้าว โคเมะโคจิ และน้ำเท่านั้น และไม่มีแอลกอฮอล์กลั่น ดังนั้นจึงมักกล่าวกันว่ามีรสชาติที่ทำให้คุณสัมผัสถึงรสชาติและความเข้มข้นของข้าวได้ เป็นไปได้ว่าวาลีนและโพรลีนเกี่ยวข้องกับรสชาติอันเป็นเอกลักษณ์ของจุนไมชูที่วัดในครั้งนี้

รูปที่ 3 ผลการวิเคราะห์คลัสเตอร์แบบลำดับชั้น (HCA)

รูปที่ 4 ผลการเปรียบเทียบความเข้มสูงสุด
(A) โพรลีน (B) วาลีน

ผลการวิเคราะห์โครงสร้าง AI ของสารประกอบที่ไม่รู้จัก

ในงานนี้ ตรวจพบสารประกอบหลายชนิดที่ไม่ได้ลงทะเบียนในฐานข้อมูลไลบรารี ตัวอย่างเช่น เราจะอธิบายผลการวิเคราะห์แบบผสมผสานและการวิเคราะห์โครงสร้างสำหรับ RT สูงสุด 17.82 นาที ในรูปที่ 2 สเปกตรัมมวลของสารประกอบนี้ใน Honjozo-shu ถูกแสดง รูปที่ 5 ไอออนโมเลกุล ม./ซ 947 ถูกตรวจพบโดย FI ไอออนไนซ์แบบอ่อนเท่านั้น ไม่ใช่โดย EI สูตรโมเลกุลประมาณว่าคือ C₃₇H₈₉NO₁₁Si₈ จากผลการประมาณองค์ประกอบธาตุของไอออนโมเลกุลใน FI สูตรโมเลกุลนี้สันนิษฐานว่าได้มาจากการทำให้เป็นอนุพันธ์ของออกไซม์และ TMS ของไดแซ็กคาไรด์แบบรีดิวซ์ อย่างไรก็ตาม ค่า RI ของสารประกอบที่มีสูตรโมเลกุลตรงกันและมีค่าอันดับ 1 ในไลบรารี DB (β-gentiobiose, octakis(trimethylsilyl) ether, methyloxime (isomer 1)) มีค่า RI ต่างกันมากที่ Δ169 ( ตารางที่ 2) ดังนั้นส่วนประกอบนี้จึงสันนิษฐานว่าเป็นส่วนประกอบที่ไม่ได้ลงทะเบียนใน Library DB แม้ว่าสูตรโมเลกุลของมันคือ C₃₇H₈₉NO₁₁Si₈- รูปที่ 6 แสดงผลการวิเคราะห์โครงสร้าง AI ของสารประกอบนี้ ตัวเลือกแรกคืออนุพันธ์ของไอโซมอลทูโลสของไดแซ็กคาไรด์ เนื่องจากอนุพันธ์ของไอโซมอลทูโลสไม่ได้รับการลงทะเบียนในไลบรารี NIST จึงเป็นไปได้ว่าส่วนประกอบนี้คือไอโซมอลทูโลส
ในรายงานนี้ FI สามารถตรวจจับไอออนของโมเลกุลได้อย่างชัดเจนแม้แต่กับส่วนประกอบที่มีมวลสูงซึ่งยากต่อการวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์เมแทบอลิซึมโดยใช้ EI นอกจากนี้ ยังสามารถประมาณสูตรโครงสร้างได้แม้ว่าจะยังไม่ได้ลงทะเบียนในฐานข้อมูลไลบรารีก็ตาม

รูปที่ 5 สเปกตรัมมวลของสารประกอบที่ไม่รู้จัก

ตารางที่ 2 ผลการวิเคราะห์เชิงคุณภาพเชิงบูรณาการของสารประกอบที่ไม่รู้จัก

รูปที่ 6 ผลการวิเคราะห์โครงสร้าง AI ของสารประกอบที่ไม่รู้จัก

สรุป

ใน MSTips นี้ เราได้แนะนำผลลัพธ์ของการวิเคราะห์สารเมตาบอไลต์ในสาเกแบบไม่กำหนดเป้าหมายโดยใช้แก๊สโครมาโตกราฟีตามเวลาการบินแมสสเปกโตรมิเตอร์ (GC-TOFMS) แม้แต่เมตาบอไลต์ที่มีขั้วสูงซึ่งยากต่อการวัดโดยใช้การวัด GC-MS แบบเดิมๆ ก็สามารถวัดได้อย่างง่ายดายโดยการทำให้เกิดอนุพันธ์ของ TMS นอกจากนี้ การวิเคราะห์หลายตัวแปรยังทำให้สามารถจำแนกประเภทสาเกได้ แม้แต่อนุพันธ์ของไดแซ็กคาไรด์ TMS ซึ่งวัดด้วย GC-QMS ได้ยากเนื่องจากมีน้ำหนักโมเลกุลสูง เราก็สามารถวัดไอออนของโมเลกุลได้โดยใช้ GC-TOFMS และ FI สำหรับสารประกอบที่ยังไม่ได้ลงทะเบียนในฐานข้อมูลไลบรารี เราสามารถประมาณสูตรโครงสร้างของสารประกอบได้โดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์โครงสร้างสารประกอบที่ไม่รู้จัก msFineAnalysis AI
จากผลลัพธ์ข้างต้น ได้รับการยืนยันว่า GC-TOFMS และ msFineAnalysis AI มีประสิทธิภาพในด้านเมแทบอลิซึมโดยใช้ GC-MS

อ้างอิง

1) สำนักงานภาษีแห่งชาติญี่ปุ่น 2023. ภาพรวมของ "มาตรฐานการแสดงคุณภาพวิธีการผลิตสาเก".
https://www.nta.go.jp/taxes/sake/hyoji/seishu/gaiyo/02.htm (เขียนเป็นภาษาญี่ปุ่น)
2) M. Ubukata และคณะ สเปกตรัมมวลชุมชนอย่างรวดเร็ว 2020; 34:e8820.
3) อ. คูโบ และคณะ มวลสาร, 2023, 12, A0120.
4) MetaboAnalyst 6.0 https://metaboanalyst.ca/
5) ฮารุโอะ โอกาวะ. ส่วนผสมและรสชาติสาเกญี่ปุ่น วารสารสมาคมญี่ปุ่นว่าด้วยกลิ่นสิ่งแวดล้อม ฉบับที่ 46 ฉบับที่ 5 ปี 2015 (เขียนเป็นภาษาญี่ปุ่น)

การแก้ปัญหาตามสาขา

เคมี

ชีววิทยา / วิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต

อาหาร / พืช

รายการสินค้า ที่เกี่ยวข้อง

JMS-T2000GC AccuTOF™ GC-Alphaโครมาโตกราฟีก๊าซประสิทธิภาพสูง- สเปกโตรมิเตอร์มวลเวลาบิน

msFineAnalysis AIซอฟต์แวร์วิเคราะห์โครงสร้างสารประกอบที่ไม่รู้จัก

หมวดหมู่สินค้า

แก๊สโครมาโทกราฟี-แมสสเปกโตรมิเตอร์(GC-MS)