ใน CLEM เรซินพร้อมสารละลายคืนสภาพเรืองแสง | หมายเหตุการใช้งาน

SM2021-03E

เมื่อเร็ว ๆ นี้ มีการสังเกตปรากฏการณ์ทางสรีรวิทยาต่าง ๆ และการแปลของสารชีวภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงโดยใช้สีย้อมเรืองแสงและโปรตีนเรืองแสง CLEM เป็นวิธีการสังเกตตัวอย่างเดียวกันด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงและกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน และรวมภาพการสังเกตเหล่านี้เพื่อรวมข้อมูลที่ได้รับจากเครื่องมือแต่ละชนิด ดังนั้น จึงจำเป็นต้องมีการจัดตำแหน่งที่มีความแม่นยำสูงสำหรับการผสานภาพนี้ อย่างไรก็ตาม การเรืองแสงของสีย้อมเรืองแสงและโปรตีนที่สังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงจะดับลงโดยการเตรียมตัวอย่างสำหรับการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (การตรึง การคายน้ำ การฝังเรซิน ฯลฯ) การสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงและการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนจะต้องดำเนินการภายใต้เงื่อนไขที่แตกต่างกัน CLEM-สีแดง^*1 เป็นโปรตีนฟลูออเรสเซนต์ที่นำฟลูออเรสเซนต์กลับคืนมาโดยการบำบัดด้วยสารละลายฟลูออเรสเซนซ์ที่ฟื้นกลับมา (สารละลาย TUK^*2) แม้หลังจากการตรึงด้วยกลูตาราลดีไฮด์หรือออสเมียมเตทรอกไซด์ และการเรืองแสงนี้ยังคงอยู่แม้หลังจากฝังในเรซิน ด้วยการใช้ CLEM-Red และโซลูชันการกู้คืนฟลูออเรสเซนซ์ เราสามารถสังเกตส่วนที่บางเฉียบหลังจากการฝังเรซินด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ ซึ่งทำให้ CLEM มีความแม่นยำสูง

โปรโตคอล

^{* 1,2} โซลูชัน CLEM-Red, TUK เป็นผลิตภัณฑ์ของ Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation

ผลสอบ

ปรากฏการณ์ของการสลายตัวของออร์แกเนลล์และโปรตีนที่ไม่จำเป็นในเซลล์เรียกว่า autophagy ใน autophagy นี้ autophagosome ที่เป็นโครงสร้างเมมเบรนล้อมรอบสารที่ไม่จำเป็นจะถูกสังเกต มีคนแนะนำว่าโปรตีน p62 มีบทบาทสำคัญในการก่อตัวของออโตฟาโกโซมนี้ เซลล์ HeLa ที่แสดงออกมากเกินไปของฟิวชันโปรตีนของ p62 และ CLEM-Red ถูกพบในเรซิน CLEM
จากการสังเกตนี้ ฟิวชันโปรตีน CLEM-red-p62 ถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในโครงสร้างหยดน้ำมันของเซลล์ และเกิดออโตฟาโกโซมในบริเวณที่อยู่ติดกัน

ตัวอย่าง: เซลล์เฮลา, pCLEM-Red-p62
กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล: A1 (Nikon)
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด: JSM-7900F (JEOL)

บทบัญญัติตัวอย่าง
ดร. อิเซย์ ทานิดะ, ศ. ยาสุโอะ อุจิยามะ (มหาวิทยาลัยจุนเทนโด, โตเกียว)

อ้างอิง

ทานิดะ I, Haruta T, Suga M, Takei S, Takebe A, Furuta Y, Yamaguchi J, Oliva
Trejo JA, Kakuta S, Uchiyama Y. โครงสร้างเมมเบรนสัมผัสโดยตรง
ด้วยตัว p62/SQSTM1
เจ ฮิสโตเคม ไซโตเคม 2021 มิ.ย.; 69(6) : 407-414.