การวิเคราะห์โครงสร้างสามมิติของโปรตีนอย่างรวดเร็วเป็นพิเศษ
— การเตรียมตัวอย่างสำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-EM) ภายใน 10 นาที —

สัมภาษณ์ 15

สึโยชิ อิโนะอุเอะ
ห้องปฏิบัติการวิเคราะห์โครงสร้างและหน้าที่ของชีวโมเลกุล
บัณฑิตวิทยาลัยเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยโอซาก้า

โครงสร้างสามมิติของโมเลกุลชีวภาพ เช่น โปรตีน กำลังกลายเป็นข้อมูลสำคัญสำหรับการวิจัยและพัฒนาทางชีวเคมีและการค้นพบยา ในขณะที่วิธีการวิเคราะห์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-EM) เป็นที่แพร่หลาย เครื่องมือที่จะช่วยเพิ่มความเร็วในการวิเคราะห์อย่างมาก นั่นคือ "EG-grid™" ได้รับการพัฒนาโดยศาสตราจารย์อิโนอุเอะ เราได้สัมภาษณ์ศาสตราจารย์อิโนอุเอะเกี่ยวกับคุณลักษณะของเครื่องมือนี้

การแทรกซึมอย่างรวดเร็วของไครโอ-เอ็ม

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-EM) เป็นวิธีการวิเคราะห์โครงสร้างสามมิติของโปรตีนที่แพร่หลายอย่างรวดเร็ว ในฐานข้อมูลสาธารณะระหว่างประเทศ PDB (Protein Data Bank) ข้อมูลโครงสร้างสามมิติของโมเลกุลชีวภาพ (โปรตีน กรดนิวคลีอิก ฯลฯ) ที่ค้นพบใหม่จะถูกบันทึกไว้ทุกวัน ข้อมูลจะถูกเปิดเผยเมื่อมีการเผยแพร่บทความที่เกี่ยวข้อง ในบรรดาข้อมูลโครงสร้างที่เปิดเผย ข้อมูลที่ได้จากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนมีจำนวนถึง 5,791 รายการในปี 2024 ซึ่งคิดเป็น 37% ของจำนวนข้อมูลทั้งหมดที่เปิดเผยในปีนั้น

จากกราฟจะเห็นว่าข้อมูลที่ได้จากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนเริ่มเพิ่มขึ้นประมาณปี 2017
ในปีนี้ นักวิจัยทั้งสามท่านที่พัฒนาเทคโนโลยีพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอ ได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมี ศาสตราจารย์สึโยชิ อิโนอุเอะ (บัณฑิตวิทยาลัยเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยโอซาก้า) กล่าวว่า "รางวัลโนเบลเป็นแรงกระตุ้นที่ทำให้ผู้คนตระหนักถึงกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอและวิธีการใช้งานมากขึ้น ส่งผลให้การใช้งานเพิ่มมากขึ้น"
เหตุผลที่กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (Cryo-EM) ได้รับความนิยมคือ ไม่จำเป็นต้องมีการตกผลึกของโปรตีน ซึ่งเคยเป็นกระบวนการที่หลีกเลี่ยงไม่ได้ในการวิเคราะห์โครงสร้างผลึกด้วยรังสีเอกซ์ การวิเคราะห์โครงสร้างผลึกด้วยรังสีเอกซ์เป็นวิธีการหลักในการอธิบายโครงสร้างสามมิติ อย่างไรก็ตาม ในวิธีนี้ โปรตีนจำเป็นต้องถูกทำให้เป็นผลึกขนาดใหญ่ประมาณ 100 ไมโครเมตร การเตรียมตัวอย่างใช้เวลานานหลายเดือนหรือมากกว่านั้น นอกจากนี้ยังมีโปรตีนและสารประกอบเชิงซ้อนบางชนิดที่ยากต่อการตกผลึก Cryo-EM สามารถวิเคราะห์โปรตีนที่ยากต่อการตกผลึกได้ ซึ่งเป็นข้อได้เปรียบของ Cryo-EM
นอกจากนี้ การวิเคราะห์ยังสามารถทำได้แม้จะมีตัวอย่างเพียงปริมาณน้อย ซึ่งถือเป็นข้อดีอย่างมากอีกประการหนึ่ง การวิเคราะห์โครงสร้างที่ซับซ้อนก็กลายเป็นเรื่องง่าย แม้แต่กับโปรตีนที่มีการ精製ยาก และสารประกอบเชิงซ้อนที่ไม่เสถียรและมีแนวโน้มที่จะรวมตัวกันได้ง่าย

การเตรียมตัวอย่างใช้เวลาหนึ่งเดือน แม้แต่สำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-EM)

แล้วการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-EM) ต้องมีการเตรียมตัวอย่างก่อนหรือไม่? ใช่ ต้องมีการเตรียมตัวอย่าง ในช่วงแรก การเตรียมตัวอย่างและการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนนั้นใช้เวลาพอสมควร

สำหรับการวิเคราะห์โครงสร้างสามมิติ จะใช้วิธีการวิเคราะห์อนุภาคเดี่ยว ในวิธีนี้ จะมีการถ่ายภาพอนุภาคเดี่ยวจำนวนมากโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-EM) เพื่อเพิ่มความแม่นยำ จำเป็นต้องเตรียมภาพจำนวนมากจากมุมต่างๆ และนำมาสร้างเป็นโครงสร้างสามมิติโดยใช้คอมพิวเตอร์ เพื่อจุดประสงค์นี้ จำเป็นต้องเตรียมตัวอย่างที่เหมาะสมซึ่งช่วยให้สามารถถ่ายภาพได้อย่างมีประสิทธิภาพ ส่งผลให้ความเร็วในการวิจัยโดยรวมดีขึ้น

สำหรับการเตรียมตัวอย่างนั้น วิธีการฝังโปรตีนในน้ำแข็งเป็นวิธีที่ใช้กันมาแต่เดิม วิธีนี้เป็นวิธีการแช่แข็งสารละลายอย่างรวดเร็วเพื่อฝังโปรตีนไว้ในน้ำแข็งที่ไม่มีรูปร่าง อย่างไรก็ตาม วิธีนี้มีข้อจำกัดในการปรับความเข้มข้น หากความเข้มข้นสูงเกินไป อนุภาคจะทับซ้อนกันและจะไม่สามารถได้ภาพที่ใช้งานได้ ในทางกลับกัน หากความเข้มข้นต่ำเกินไป จำนวนอนุภาคจะลดลงและประสิทธิภาพการถ่ายภาพจะลดลง นอกจากนี้ หากน้ำแข็งมีความหนาและอนุภาคโปรตีนกระจายตัวในทิศทางความหนา จำนวนอนุภาคที่สามารถโฟกัสได้จะมีจำกัด ทำให้ประสิทธิภาพการถ่ายภาพลดลงไปอีก

"การปรับความเข้มข้นเป็นเรื่องยาก แต่ปัญหาที่สำคัญที่สุดในวิธีการฝังตัวในน้ำแข็งคือทิศทางการเรียงตัวที่เหมาะสม ซึ่งโปรตีนจะเรียงตัวไปในทิศทางเดียวกัน!" (ศาสตราจารย์อิโนอุเอะ)

การจัดเรียงตัวในทิศทางที่ต้องการจะเกิดขึ้นระหว่างกระบวนการแช่แข็ง แต่ในบางกรณี การจัดเรียงตัวไปในทิศทางเดียวกันอาจเกิดขึ้นก่อนการแช่แข็ง กรณีเหล่านี้เกิดขึ้นเมื่อโปรตีนที่มีคุณสมบัติไม่ชอบน้ำสูงเกาะติดกับส่วนต่อประสานระหว่างแก๊สและของเหลว ส่งผลให้มีการจัดเรียงตัวไปในทิศทางเดียวกัน ในวิธีการเตรียมตัวอย่างแบบดั้งเดิม อาจต้องใช้เวลาถึงหนึ่งเดือนในการพิจารณาสภาวะเหล่านี้

ศาสตราจารย์อิโนอุเอะและคณะประสบความสำเร็จในการพัฒนาเครื่องมือเตรียมตัวอย่าง "EG-grid™ (Epoxidized Graphen Grid)" ซึ่งเป็นทางออกที่ดีเยี่ยมสำหรับปัญหาเหล่านั้น EG-grid™ เป็นฐานรองรับที่ทำจากกราฟีนที่มีหมู่เอพ็อกซี เนื่องจากหมู่เอพ็อกซีมีคุณสมบัติในการจับกับหมู่ไลซีนที่อยู่บนพื้นผิวของอนุภาคโปรตีน ทำให้โปรตีนยึดเกาะได้ในมุมต่างๆ ความหนาแน่นของหมู่เอพ็อกซีถูกกำหนดไว้ล่วงหน้าอย่างเหมาะสม จึงไม่จำเป็นต้องกังวลเกี่ยวกับการปรับความเข้มข้นของสารละลาย และไม่มีการกระจายตัวในทิศทางความหนา ทำให้สามารถโฟกัสภาพได้อย่างเหมาะสม

ด้วยการใช้ EG-grid™ เวลาในการเตรียมตัวอย่างซึ่งก่อนหน้านี้ใช้เวลาเกือบหนึ่งเดือนได้ลดลงเหลือเพียงประมาณ 10-15 นาที และสามารถนำตัวอย่างไปวางบนกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็งได้ภายใน 20 นาที แม้จะรวมกระบวนการแช่แข็งแล้วก็ตาม

ประสิทธิภาพการถ่ายภาพก็ได้รับการปรับปรุงเช่นกัน จำนวนอนุภาคที่ใช้งานได้จากการถ่ายภาพเพียงครั้งเดียวเพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับวิธีการฝังในน้ำแข็ง ซึ่งช่วยลดจำนวนภาพทั้งหมดที่จำเป็น สำหรับโปรตีนบางชนิด การวิเคราะห์อาจเสร็จสมบูรณ์ได้โดยใช้ภาพเพียงหนึ่งในสิบหรือหนึ่งในยี่สิบของจำนวนภาพแบบเดิม

การพัฒนาเริ่มต้นจาก "น้ำยาฆ่าเชื้อ/ระงับกลิ่นปริศนา"

การพัฒนา EG-grid™ เริ่มต้นจากการได้พบกับ "น้ำยาฆ่าเชื้อ/ดับกลิ่นปริศนา" ชนิดหนึ่ง

ในปี 2015 มีการตั้งคำถามไปยังมหาวิทยาลัยโอซาก้าว่า "เมื่อผู้ป่วยมะเร็งช่องปากระยะสุดท้ายใช้ยาฆ่าเชื้อ/ระงับกลิ่นนี้เพื่อควบคุมกลิ่น ปรากฏว่ามะเร็งกลับถดถอยลง คุณช่วยตรวจสอบกลไกที่อยู่เบื้องหลังได้หรือไม่? ถ้าผลเป็นจริง เราอยากจะนำไปพัฒนาเป็นยาต้านมะเร็ง" พร้อมกับคำขอครั้งนี้ ได้มีการส่งขวด "น้ำปริศนา" มาให้ด้วย
เราถามว่า "ส่วนผสมมีอะไรบ้าง?" คำตอบที่ได้คือ "เราไม่สามารถเปิดเผยได้"
ฟังดูค่อนข้างน่าสงสัย อย่างไรก็ตาม เมื่อมอบหมายให้ศาสตราจารย์ชุนอิจิ ฟุกุซูมิ จากบัณฑิตวิทยาลัยวิศวกรรมศาสตร์ (ในขณะนั้น) ผู้เชี่ยวชาญด้านอนุมูลอิสระเป็นผู้ทำการวิเคราะห์ เขาก็สามารถระบุส่วนประกอบหลักและกลไกพื้นฐานได้อย่างรวดเร็ว

ส่วนประกอบหลักคือไอออนคลอไรต์ (ClO)₂-) ปรากฏว่าไอออนนี้ (ClO)₂-) ผลิตคลอรีนไดออกไซด์ (ClO) ที่มีปฏิกิริยา₂) ในน้ำปริมาณเท่าที่จำเป็นเฉพาะเมื่อมีแบคทีเรียและไวรัสเป้าหมายอยู่เท่านั้น - นี่คือกลไกการทำงาน

ต่อมา มหาวิทยาลัยโอซาก้าตัดสินใจเรียก "น้ำ" ที่ปลอดภัยสูงนี้ว่า MA-T: Matching Transformation System (ระบบการเปลี่ยนแปลงที่เข้ากันได้) เพื่อหลีกเลี่ยงความสับสนกับสารอื่นๆ ที่สามารถก่อให้เกิดก๊าซคลอรีนได้

ศาสตราจารย์โอคุโบะ (ในขณะนั้น) ซึ่งได้รับแต่งตั้งเป็นพิเศษและรับผิดชอบการวิเคราะห์ในกลุ่มวิจัยเดียวกันกับศาสตราจารย์ฟุกุซูมิ เป็นผู้เชี่ยวชาญด้านเคมีแสง เขาเกิดความสนใจว่า "จะเกิดอะไรขึ้นถ้าเราฉายแสงลงบนสิ่งนี้?" ภายใต้สภาวะที่เป็นกรด เขาได้ปล่อยคลอรีนไดออกไซด์ออกมาเป็นก๊าซและนำไปฉายแสง เขาพบว่ามันแตกตัวเป็นสารออกซิเจนที่ว่องไวและอนุมูลคลอรีน นอกจากนี้เขายังพบว่าการใช้สารออกซิเจนที่ว่องไวและอนุมูลคลอรีนเหล่านี้สามารถออกซิไดซ์สารต่างๆ ได้

ตัวอย่างเช่น การออกซิไดซ์มีเทนจะสร้างเมทานอลและกรดฟอร์มิก โดยไม่มีการปล่อยก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ นับเป็นครั้งแรกของโลกที่สามารถสังเคราะห์เมทานอลได้ภายใต้สภาวะอุณหภูมิและความดันปกติ มีเทนสามารถได้มาจากการหมักมูลวัว หรือจากแหล่งเก็บปิโตรเลียมและก๊าซธรรมชาติ แต่การขนส่งทำได้ยาก อย่างไรก็ตาม การนำมีเทนมาแปรรูปเป็นเมทานอลและกรดฟอร์มิกเหลวทำให้การขนส่งง่ายขึ้น และการใช้งานก็ขยายวงกว้างขึ้น

EG-grid™ เป็นผลมาจากการนำปฏิกิริยาออกซิเดชันดังกล่าวมาประยุกต์ใช้ในกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-EM) หากพื้นผิวของกราฟีนถูกออกซิไดซ์เพื่อให้มีหมู่ไฮดรอกซิล (-OH) ก็จะสามารถแทนที่หมู่ฟังก์ชันที่สามารถตรึงโปรตีนไว้ได้ แนวคิดนี้จึงถูกนำมาใช้ในการพัฒนา EG-grid™
ดังนั้น ศาสตราจารย์อิโนอุเอะจึงคิดว่าปฏิกิริยาออกซิเดชันที่ค้นพบใหม่และ MA-T ที่มีความปลอดภัยสูงนั้นสามารถนำไปประยุกต์ใช้ได้หลากหลาย และเขาจึงยื่นขอทุน OPERA (โครงการแพลตฟอร์มนวัตกรรมแบบเปิดร่วมกับองค์กร บริษัทวิจัย และสถาบันการศึกษา โดย JST (สำนักงานวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศญี่ปุ่น)) เพื่อทำการวิจัยเพิ่มเติมเกี่ยวกับการประยุกต์ใช้ในทางปฏิบัติ อย่างไรก็ตาม เพื่อให้การยื่นขอทุนได้รับการอนุมัติ จำเป็นต้องได้รับเงินทุนวิจัยร่วมจำนวนมาก และเหลือเวลาไม่ถึงสามเดือนก่อนถึงกำหนดส่ง หนึ่งในบริษัทที่ตอบรับคำขอเร่งด่วนของเขาคือ บริษัท JEOL จำกัด

JEOL ได้ก่อตั้ง "ห้องปฏิบัติการความร่วมมือวิจัยมหาวิทยาลัยโอซาก้า-JEOL YOKOGUSHI" ขึ้นในปี 2018 ดังนั้นเงินทุนวิจัยจึงมาจากห้องปฏิบัติการเหล่านี้ ข้อเสนอของศาสตราจารย์อิโนอุเอะได้รับการอนุมัติให้ใช้ในโครงการ OPERA (สำหรับช่วงเวลาตุลาคม 2019 ถึงมีนาคม 2024)
สิ่งนี้เปิดโอกาสให้มีการพัฒนา EG-grid™ และได้รับการสนับสนุนจาก JEOL ในโครงการนี้ CRYO ARM™ 200 ซึ่งได้ติดตั้งในห้องปฏิบัติการพร้อมกันนั้น

โครงการ OPERA นี้ประสบความสำเร็จอย่างมากและได้รับการประเมินในระดับสูง ในเดือนกุมภาพันธ์ 2024 โครงการนี้ได้รับรางวัลจากนายกรัฐมนตรีจากทั้งหมด 6 รางวัล^th รางวัลนวัตกรรมเปิดแห่งญี่ปุ่น งานวิจัยเกี่ยวกับการออกซิไดซ์มีเทนได้รับการยกย่องชมเชยด้านวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีจากรัฐมนตรีว่าการกระทรวงศึกษาธิการ วัฒนธรรม กีฬา วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี ในเดือนเมษายน พ.ศ. 2024 นอกจากนี้ ความพยายามของพวกเขายังได้รับการคัดเลือกในข้อเสนอของสภาวิทยาศาสตร์แห่งญี่ปุ่นเรื่อง "พลังร่วมของภาคอุตสาหกรรม รัฐบาล สถาบันการศึกษา และประชาชนในการแก้ไขวิกฤตสภาพภูมิอากาศ" (เผยแพร่ในเดือนตุลาคม พ.ศ. 2025)

บริษัทได้รับสิทธิบัตรจำนวนมาก จากการเรียกร้องของบริษัทหลายแห่งที่ต้องการใช้สิทธิบัตร จึงได้มีการก่อตั้งสมาคมอุตสาหกรรม MA-T แห่งประเทศญี่ปุ่นขึ้น (พฤศจิกายน 2020) ปัจจุบันมีบริษัทสมาชิก 91 บริษัท และสมาชิกสนับสนุนอีก 22 บริษัท/องค์กร (ข้อมูล ณ เดือนมกราคม 2025) ในงาน EXPO 2025 ที่โอซาก้า คันไซ บริษัท MA-T ได้จัดบูธใน "Osaka Healthcare Pavilion" และจัดแสดงผลิตภัณฑ์ดูแลช่องปากสำหรับมนุษย์และสัตว์เลี้ยง รวมถึงผลิตภัณฑ์ดูแลสิ่งแวดล้อมแบบฉีดพ่น/กระจายตัว ซึ่งทั้งสองอย่างนี้แสดงให้เห็นถึงศักยภาพด้านความปลอดภัยสูงของ MA-T

ขอบเขตการใช้งาน Cryo-EM ขยายกว้างขึ้น

ปัจจุบัน ผลิตภัณฑ์ในกลุ่มเดียวกันกับ EG-grid™ ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ที่มีหมู่ฟังก์ชันอื่นแทนหมู่เอพ็อกซี กำลังอยู่ระหว่างการพิจารณา เมื่อมีการติดกรดคลอไรด์ (สารประกอบคลอรีน) เข้าไป มันจะจับกับโปรตีน (หมู่เอมีนและหมู่ไทออล) ได้เร็วกว่าหมู่เอพ็อกซี อย่างไรก็ตาม การจัดการทำได้ยาก ทำให้ไม่สามารถทำการตลาดไปทั่วโลกได้ “เป็นไปได้หรือไม่ที่จะตรึงโปรตีนด้วย His tag?” – เพื่อตอบคำถามดังกล่าว จึงได้มีการพัฒนาต้นแบบหลายชิ้นขึ้นมาแล้ว แต่โปรตีนทั้งหมดจะเรียงตัวไปในทิศทางเดียวกัน ซึ่งเป็นข้อเสีย “ถึงกระนั้น เนื่องจากเราสามารถถ่ายภาพจากมุมที่แตกต่างจากทิศทางที่ต้องการได้ มันจึงสามารถใช้เป็นวิธีแก้ปัญหาเฉพาะหน้าได้” (ศาสตราจารย์อิโนอุเอะ)

เมื่อพิจารณาถึงจุดอ่อนของการผสมผสานระหว่าง Cryo-EM และการวิเคราะห์อนุภาคเดี่ยว พบว่าไม่เหมาะกับโปรตีนขนาดเล็ก ในอดีตเคยกล่าวกันว่าต้องใช้โปรตีนที่มีมวล 100,000 Da(*) ขึ้นไป อย่างไรก็ตาม ปัจจุบันสามารถวิเคราะห์โปรตีนที่มีมวล 50,000 ถึง 60,000 Da ได้แล้ว ขอบเขตของการวิเคราะห์โครงสร้างสามมิติโดยใช้ Cryo-EM จึงขยายตัวมากขึ้นเรื่อยๆ

*ดา (Dalton): หน่วยวัดมวลที่กำหนดให้เป็นหนึ่งในสิบสองของมวลของอะตอมคาร์บอน-12

"เมื่อก่อน การวิเคราะห์โครงสร้างผลึกด้วยรังสีเอกซ์เป็นวิธีเดียวที่เราใช้ เรามักกังวลว่าโปรตีนนี้จะสามารถตกผลึกได้หรือไม่ และถ้าได้ จะเกิดขึ้นเมื่อไหร่" (ศาสตราจารย์อิโนอุเอะ) ปัจจุบัน กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-EM) กลายเป็นวิธีหลักที่ใช้กันทั่วไป ทำให้สามารถวิเคราะห์โปรตีนที่มีมวลในระดับหนึ่งได้ทันที

ขณะนี้ความต้องการ EG-grid™ กำลังเพิ่มสูงขึ้นอย่างมาก