การวิเคราะห์ HSQC-TOCSY│ทำความเข้าใจการประยุกต์ใช้ NMR 2 มิติเมื่อเปรียบเทียบกับ TOCSY

HSQC-TOCSY คืออะไร?

HSQC-TOCSY เป็นการทดลอง NMR สองมิติที่สามารถตรวจวัดการเชื่อมต่อโดยตรงได้พร้อมกัน ¹H-¹³ความสัมพันธ์ C โดย HSQC และข้อมูลเครือข่ายสปินโดย TOCSY ส่งผลให้สังเกตเห็นความสัมพันธ์แบบ TOCSY ด้วย ¹³การแยกค่าการเปลี่ยนแปลงทางเคมีของคาร์บอน (C chemical-shift resolution)

HSQC-TOCSY เป็นการผสมผสานของกลไกทั้งสองอย่าง:

• ส่วนประกอบ HSQC: เพื่อตรวจจับ ¹H ที่เชื่อมโยงโดยตรงกับสิ่งใดก็ตามที่กำหนดไว้ ¹³C
• ส่วนประกอบ TOCSY: เพื่อส่งต่อสนามแม่เหล็กไปยัง ¹H ในเครือข่ายสปินเดียวกัน เริ่มต้นจาก ¹H.

ดังนั้น สำหรับกรณีใดๆ ก็ตาม ¹³C,

• ¹H ที่เชื่อมต่อโดยตรงกับ ¹³C (ความสัมพันธ์ HSQC)
• อื่นๆ ¹Hs เชื่อมต่อผ่านเครือข่ายสปินเดียวกันกับ ¹H (ความสัมพันธ์ TOCSY) ปรากฏในสเปกตรัม HSQC-TOCSY

การเปรียบเทียบสเปกตรัม TOCSY และ HSQC-TOCSY

รูปที่ 1 แผนภาพแสดงการทำงานของ TOCSY (ซ้าย) แผนภาพแสดงการทำงานของ HSQC-TOCSY (ขวา)

ดังแสดงในรูปที่ 1 เมื่อสัญญาณโปรตอนซ้อนทับกันอย่างมาก พีคครอส TOCSY ที่สอดคล้องกันก็จะซ้อนทับกันด้วย ทำให้การวิเคราะห์สเปกตรัมทำได้ยาก อย่างไรก็ตาม ใน HSQC-TOCSY แกน Y แสดงถึง ¹³ค่าการเลื่อนทางเคมีของคาร์บอน (C chemical shift) มีช่วงการกระจายตัวของค่าการเลื่อนทางเคมีระหว่างสัญญาณแต่ละสัญญาณมากกว่า การกระจายตัวที่เพิ่มขึ้นนี้ช่วยให้สามารถแยกสัญญาณที่มีความสัมพันธ์กันได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น จึงช่วยอำนวยความสะดวกในการวิเคราะห์สเปกตรัม

รูปที่ 2 แผนภาพแสดงสเปกตรัม HSQC-TOCSY

นอกจากนี้ เช่นเดียวกับ TOCSY แล้ว HSQC-TOCSY ยังช่วยให้สามารถส่งสัญญาณแบบรีเลย์ได้ยาวนานขึ้นภายในระบบสปินโดยการขยายเวลาการผสม เมื่อพิจารณาสัญญาณความสัมพันธ์ ¹³C_A ในรูปที่ 2 เมื่อเวลาในการผสมสั้น ผลลัพธ์จะเหมือนกับสเปกตรัม HSQC แต่เมื่อเวลาในการผสมนานขึ้น การถ่ายโอนสนามแม่เหล็กจะเกิดขึ้น ¹H_B, ¹H_Cและสัญญาณสหสัมพันธ์กับ ¹H_B, ¹H_C ปรากฏ

ตัวอย่างการวิเคราะห์ HSQC-TOCSY ของเซดรอล

เซดรอลเป็นสารประกอบเทอร์พีนอยด์ ซึ่งเป็นสารประกอบให้กลิ่นหอมที่พบในไม้ซีดาร์และไม้ไซเปรส ภาพที่ 3 แสดงให้เห็นถึง... ¹สเปกตรัม 1H ของเซดรอล สัญญาณโปรตอน OH ปรากฏที่ 2.9 ppm แต่สัญญาณอื่นๆ ¹สัญญาณ H ทั้งหมดถูกตรวจพบในช่วงแคบๆ ประมาณ 1 ppm บริเวณนี้จะกล่าวถึงโดยละเอียดในรูปที่ 4

มะเดื่อ. 3 ¹สเปกตรัม H ของเซดรอล

มะเดื่อ. 4 ¹สเปกตรัม H ของเซดรอล

จากสนามสูง โปรตอนของหมู่เมทิลสี่หมู่ (-CH)₃ตรวจพบ )
ในบริเวณที่วงกลมสีชมพู โปรตอนจากหมู่เมทิลีนห้าหมู่ (-CH)₂-) และหมู่เมทินสามหมู่ (-CH-) ซ้อนทับกัน สาเหตุที่บริเวณที่วงกลมสีชมพูมีสัญญาณซ้อนทับกันอย่างมากนั้น เกิดจาก "หมู่เมทิลีนที่ไม่สมมูลกัน" จำนวนมากที่มีอยู่ในโมเลกุล

หมู่เมทิลีนในโซ่แอลคิลที่หมุนได้อย่างอิสระ ถือว่าอยู่ในสภาพแวดล้อมที่เทียบเท่ากันในทาง NMR และค่าการเลื่อนทางเคมีของโปรตอนในหมู่เมทิลีนดังกล่าวจะเท่ากัน
อย่างไรก็ตาม ในสารประกอบแบบวงแหวน เช่น เซดรอล การหมุนถูกจำกัด ดังนั้น โปรตอนของหมู่เมทิลีนจึงอยู่ในสภาพแวดล้อมที่ไม่สมดุล และสัญญาณเหล่านี้จึงมีค่าการเลื่อนทางเคมีที่แยกจากกัน
หมู่เมทิลีนประเภทนี้เรียกว่า "เมทิลีนที่ไม่สมมูล"

รูปที่ 5 สเปกตรัม COSY (ซ้าย) และสเปกตรัม TOCSY (ขวา) ของเซดรอล

รูปที่ 5 แสดงสเปกตรัมของ COSY และ TOCSY (เวลาผสม: 200 มิลลิวินาที) จากเครื่องสเปกโทรเมตร NMR ความถี่ 400 เมกะเฮิร์ตซ์ ในสเปกตรัมทั้งสอง มีบริเวณที่สัญญาณซ้อนทับกัน ทำให้การวิเคราะห์สเปกตรัมซับซ้อนขึ้น

แม้ว่าจะพยายามวิเคราะห์โดยใช้โปรตอนของหมู่เมทิลที่มีค่าการเลื่อนทางเคมีห่างไกลกัน เครือข่ายสปินก็จะถูกขัดจังหวะเนื่องจากคาร์บอนที่อยู่ติดกับหมู่เมทิลเหล่านี้เป็นคาร์บอนควอเทอร์นารี ทำให้ยากต่อการสังเกตการถ่ายทอดสัญญาณ
นอกจากนี้ เมื่อตรวจสอบสเปกตรัม TOCSY ของหมู่เมทิลที่ตรวจพบที่ด้านสนามสูงสุด (ประมาณ 0.8 ppm) จะสังเกตเห็นสัญญาณความสัมพันธ์ แต่สัญญาณเหล่านั้นซ้อนทับกัน ทำให้ยากที่จะระบุว่าสัญญาณใดเป็นของฝ่ายใด ¹H คือรูปแบบเครือข่าย
กล่าวอีกนัยหนึ่ง บางครั้งอาจเป็นเรื่องยากที่จะระบุเครือข่ายสปินได้แม้จะใช้ TOCSY ก็ตาม ในกรณีเช่นนี้ HSQC-TOCSY จึงกลายเป็นวิธีการทดลองที่มีประสิทธิภาพ

Fig.6 ¹³ซี สเปกตรัมของเซดรอล

ก่อนการวิเคราะห์ HSQC-TOCSY นั้น ¹³มีการเก็บสเปกตรัม C และสเปกตรัม HSQC ของเซดรอล
รูปที่ 6 แสดง ¹³สเปกตรัม C ของเซดรอล
แม้ว่าสัญญาณ D ที่มาจากหมู่เมทิลจะทับซ้อนกับสัญญาณของตัวทำละลาย แต่สัญญาณทั้ง 15 สัญญาณของ ¹³C ถูกแยกและสังเกต

รูปที่ 7 สเปกตรัม HSQC ของเซดรอล

ถัดไป สเปกตรัม HSQC ของเซดรอลแสดงในรูปที่ 7 แกนแนวนอนสอดคล้องกับ ¹แกนการเปลี่ยนแปลงทางเคมีของ H ในขณะที่แกนแนวตั้งแสดงถึง ¹³ข้อมูลสเปกตรัม C HSQC เชื่อมโยงแต่ละข้อมูลเข้าด้วยกัน ¹³C ที่มีพันธะโดยตรง ¹H. ดังนั้น ความสัมพันธ์ของทั้งสอง ¹สัญญาณ H ปรากฏขึ้นสำหรับคาร์บอนหนึ่งอะตอมในกรณีของหมู่เมทิลีน

เมื่อพิจารณา "หมู่เมทิลีนที่ตำแหน่ง B" จะพบว่ามีสองหมู่ ¹ตรวจพบสัญญาณความสัมพันธ์ของ H ซึ่งบ่งชี้ว่าโปรตอนสองตัวของหมู่เมทิลีน B มีค่าการเลื่อนทางเคมีที่แตกต่างกัน
ดังนั้น HSQC จึงช่วยให้ยืนยันหมู่เมทิลีนที่ไม่สมมูลกันได้ง่าย ในเซดรอล พบว่าหมู่เมทิลีนสี่ในห้าหมู่ (B, G, H, J) เป็นหมู่เมทิลีนที่ไม่สมมูลกัน

รูปที่ 8 สเปกตรัม HSQC-TOCSY ของเซดรอล

สเปกตรัม HSQC-TOCSY ของเซดรอลแสดงในรูปที่ 8 ส่วนซ้ายสุดแสดงสเปกตรัม HSQC เมื่อวิเคราะห์สเปกตรัม HSQC-TOCSY สัญญาณที่สังเกตได้ในสเปกตรัม HSQC (สัญญาณที่เกิดจากพันธะโดยตรง) ¹H-¹³ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ C ถือเป็นจุดเริ่มต้นของการส่งต่อข้อมูล
จากนั้น เช่นเดียวกับใน TOCSY แบบดั้งเดิม โดยการเปรียบเทียบสเปกตรัมที่มีเวลาการผสมที่แตกต่างกัน จะสามารถยืนยันการถ่ายทอดตามเครือข่ายสปินได้

ตัวอย่างเช่น การเปรียบเทียบพื้นที่ที่วงกลมด้วยเส้นประแสดงให้เห็นว่าสัญญาณความสัมพันธ์เพิ่มขึ้นตามจำนวนรีเลย์ ทีนี้ลองขยายพื้นที่เหล่านี้และสังเกตในรายละเอียดเพิ่มเติมกัน

รูปที่ 9 สเปกตรัม HSQC-TOCSY ของเซดรอล (ความสัมพันธ์ของ M)

รูปที่ 9 แสดงการเปรียบเทียบสัญญาณความสัมพันธ์ที่ขยายใหญ่ขึ้นสำหรับคาร์บอนเมทินที่ติดฉลาก M.
ที่เวลาผสม 20 มิลลิวินาที มีความสัมพันธ์กับเมทิลีนที่ไม่สมดุล B ปรากฏขึ้น ซึ่งบ่งชี้ถึงการเชื่อมต่อ MB ยิ่งไปกว่านั้น ที่เวลาผสม 40 มิลลิวินาที สัญญาณความสัมพันธ์กับเมทิลีนที่ไม่สมดุลปรากฏขึ้น H ปรากฏขึ้น ซึ่งบ่งชี้ว่า MBH เชื่อมต่อกันตามลำดับนี้
ในเทคนิค HSQC-TOCSY สัญญาณของหมู่เมทิลีนที่ไม่สมดุลกันมักจะปรากฏเป็นสองสัญญาณแยกกัน ¹สัญญาณความสัมพันธ์ H สำหรับคาร์บอนเดี่ยว ซึ่งมีข้อดีคือทำให้การระบุโปรตอนเมทิลีนที่ไม่สมมูลกันทางแม่เหล็กทำได้ง่ายขึ้น

รูปที่ 10 ความสัมพันธ์ HSQC-TOCSY ของเซดรอล

โดยการใช้ขั้นตอนการวิเคราะห์แบบเดียวกัน เราได้เครือข่ายสปินสามเครือข่ายดังแสดงในรูปที่ 10 บริเวณที่ไม่มีการถ่ายโอนสนามแม่เหล็กเพิ่มเติมเกิดขึ้นนั้น สอดคล้องกับตำแหน่งที่ ¹H-¹การถ่ายทอดสปินของ H สิ้นสุดลงโดยคาร์บอนควอเทอร์นารีที่อยู่ระหว่างกลาง
เพื่อดำเนินการวิเคราะห์โครงสร้างในขั้นตอนต่อไป จำเป็นต้องวิเคราะห์... ¹มือ ¹³การหาความสัมพันธ์ระยะไกลของ C (สเปกตรัม HMBC) และการกำหนดโครงสร้างระนาบให้สมบูรณ์

สรุปเกี่ยวกับ COSY, TOCSY และ HSQC-TOCSY

สุดท้ายนี้ เราจะสรุปคุณลักษณะของ COSY, TOCSY และ HSQC-TOCSY
COSY เป็นสเปกตรัม NMR 2 มิติพื้นฐานและจำเป็น เนื่องจากสามารถวัดได้ง่ายด้วยความไวสูง
เป็นขั้นตอนแรกในการวิเคราะห์โครงสร้างโมเลกุล ซึ่งเป็นที่นิยมใช้กันอย่างแพร่หลายตั้งแต่ระดับเริ่มต้นจนถึงระดับผู้เชี่ยวชาญ

ในทางกลับกัน TOCSY และ HSQC-TOCSY มีประโยชน์เมื่อ ¹สัญญาณ H อาจทับซ้อนกัน หรือเมื่อต้องการวิเคราะห์เครือข่ายสปินที่ซับซ้อน TOCSY ช่วยให้สามารถยืนยันเครือข่ายสปินทั้งหมดได้ แต่บางครั้งจำเป็นต้องวัดสเปกตรัมหลายชุดด้วยเวลาผสมที่ต่างกัน นอกจากนี้ HSQC-TOCSY ยังมีข้อได้เปรียบอย่างมากในการหลีกเลี่ยงการทับซ้อนของสัญญาณ เนื่องจากการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ของ TOCSY ดำเนินการโดยวิธี ¹³ค. อย่างไรก็ตาม เนื่องจากความไวในการวัดต่ำกว่าวิธี COSY และ TOCSY ทำให้เวลาในการวัดนานกว่าวิธี COSY และ TOCSY ซึ่งเป็นสิ่งที่ต้องให้ความสนใจ

แต่ละวิธีการวัดมีข้อดีและข้อเสีย จึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องเลือกวิธีการวัด 2D NMR ที่เหมาะสมที่สุดตามความซับซ้อนของโมเลกุลเป้าหมาย ระดับการทับซ้อนของสัญญาณ และช่วงเครือข่ายสปินที่จะวิเคราะห์

แอปพลิเคชันที่เกี่ยวข้อง

การแยกสารประกอบอินทรีย์ฟลูออรีนผสมโดยใช้สเปกโทรสโกปีแบบ 2 มิติ ¹⁹F-¹⁹F TOCSY -- เพื่อแยกข้อมูล 1 มิติ ¹⁹สเปกตรัม F NMR ของสารประกอบแต่ละชนิด--

ติดต่อเรา

หากคุณสนใจรายละเอียดเกี่ยวกับการวิเคราะห์เครือข่ายสปินโดยใช้ TOCSY และ HSQC-TOCSY และเครื่องสเปกโทรเมตร NMR โปรดติดต่อ JEOL เราพร้อมสนับสนุนความสามารถในการวิเคราะห์โครงสร้างโมเลกุลของคุณด้วยตัวอย่างการใช้งานมากมายและการสนับสนุนทางเทคนิค

ผลิตภัณฑ์

นิวเคลียร์แมกโนติกเรโซเเนนซ์สเปกโตรมิเตอร์ (NMR)

NMR เป็นคำย่อของ Nuclear Magnetic Resonance เป็นเครื่องมือที่ใช้สังเกตปรากฏการณ์เรโซแนนซ์ของสปินนิวเคลียร์โดยการวางนิวเคลียสของอะตอมไว้ในสนามแม่เหล็กเพื่อวิเคราะห์โครงสร้างโมเลกุลของสารในระดับอะตอม โดยเฉพาะอย่างยิ่ง มีประโยชน์ในการวิเคราะห์สารประกอบอินทรีย์และวัสดุพอลิเมอร์ และใช้ในด้านเภสัชกรรม ชีววิทยา อาหาร และเคมี ปัจจุบันการประยุกต์ใช้กำลังขยายตัวเพื่อรวมถึงการวิเคราะห์คุณสมบัติเชิงโครงสร้างและทางกายภาพของวัสดุอนินทรีย์ เช่น เซรามิกและแบตเตอรี่

NMR โพรบ

ด้วย NMR เครื่องตรวจจับ (หัววัด) จะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับรูปแบบตัวอย่างและเทคนิคการวัด JEOL นำเสนอหัววัดแบบสารละลายและแบบของแข็งสำหรับวัตถุประสงค์ที่หลากหลาย

NMR แม็กเน็ท

ดีไซน์ประหยัดพื้นที่พร้อมแม่เหล็กตัวนำยิ่งยวดขนาดกะทัดรัด
ความยืดหยุ่นที่มากขึ้นของรูปแบบการติดตั้งเครื่องมือเป็นไปได้ด้วยแม่เหล็กขนาดกะทัดรัดใหม่ที่มีสนามแม่เหล็กรบกวนที่เล็กกว่า

อุปกรณ์เสริมสำหรับเครื่อง NMR

ขอแนะนำอุปกรณ์ต่อพ่วง NMR เช่น เครื่องเปลี่ยนตัวอย่างอัตโนมัติและระบบเติมไนโตรเจน

ซอฟต์แวร์ NMR

แนะนำซอฟต์แวร์ที่ใช้สำหรับ NMR

อิเล็กตรอนสปินเรโซเเนนซ์สเปกโตรมิเตอร์ (ESR)

Electron Spin Resonance (ESR) เป็นวิธีการวิเคราะห์ที่มีประสิทธิภาพในการตรวจจับ วิเคราะห์ และกำหนดลักษณะของอิเล็กตรอนที่ไม่จับคู่ในสาร เป็นที่ชัดเจนว่าสถานะของอิเล็กตรอนในสารมีอิทธิพลอย่างมากต่อลักษณะและการทำงานของสาร ดังนั้นการประเมินด้วย ESR จึงมีความสำคัญมากขึ้นเรื่อยๆ สารหลายประเภท ตั้งแต่สารอิเล็กทรอนิกส์ไปจนถึงตัวเร่งปฏิกิริยา ตัวอย่างทางชีวภาพ สามารถศึกษาได้โดยไม่คำนึงว่าสารเหล่านั้นเป็นของแข็ง ของเหลว หรือก๊าซ เทคนิค ESR ที่หลากหลายสามารถทำได้โดยใช้สิ่งที่แนบมาที่เหมาะสมร่วมกับเครื่องมือพื้นฐาน

อุปกรณ์ต่อพ่วง ESR

เรามีอุปกรณ์เสริม ESR และวัสดุสิ้นเปลืองที่ทำให้การวัดที่หลากหลายเป็นไปได้