การวิเคราะห์ COSY/TOCSY │ การตีความความสัมพันธ์ของสปินโดยใช้ NMR แบบ 2 มิติ

ในคอลัมน์นี้ เราจะอธิบายหลักการพื้นฐานและวิธีการวิเคราะห์ของ COSY และ TOCSY ซึ่งเป็นเทคนิคที่เป็นตัวแทนของ NMR แบบ 2 มิติ โดยเริ่มจากการยืนยันความสัมพันธ์ระหว่างโปรตอนที่อยู่ติดกันโดยใช้ COSY จากนั้นเราจะแนะนำการวิเคราะห์เครือข่ายสปินด้วย TOCSY และการวิเคราะห์คาร์โบไฮเดรตโดยใช้ TOCSY แบบ 1 มิติและ 2 มิติ พร้อมตัวอย่างที่เป็นรูปธรรม

COSY คืออะไร?

COSY (COrrelation SpectroscopY) เป็นวิธีการพื้นฐานสำหรับการแสดงภาพความสัมพันธ์ระหว่างองค์ประกอบที่อยู่ติดกัน ¹Hs โดยใช้ 2D NMR ตามธรรมเนียมแล้ว การแยกคู่โฮโมของ ¹Hs ถูกใช้เพื่อระบุตำแหน่งใกล้เคียง ¹อะตอมไฮโดรเจนทีละตัว อย่างไรก็ตาม ด้วยการปรากฏตัวของ COSY ทำให้สามารถวิเคราะห์ได้ ¹H-¹การหาความสัมพันธ์ของคู่ควบ H พร้อมกันในช่วงกว้าง ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการวิเคราะห์โครงสร้างอย่างมาก ปัจจุบัน COSY ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะวิธีการ NMR 2 มิติเบื้องต้นสำหรับการยืนยัน ¹H-¹ความสัมพันธ์ H

รูปที่ 1 แสดงสเปกตรัม COSY สำหรับบริเวณที่สอดคล้องกับ ¹Hs ที่ 1 ถึง 6 ใน "cinnamic acid cis-3-hexenyl ester" ดังที่ระบุไว้ข้างต้น เมื่อสัญญาณความสัมพันธ์และ ¹สเปกตรัม H ของ 1D บนแกนทั้งสองเชื่อมต่อกัน สามารถสังเกตความสัมพันธ์ได้ 5 แบบ ได้แก่ 1-2, 2-3, 3-4, 4-5 และ 5-6 ผลลัพธ์นี้ทำให้เราสามารถสรุปได้ว่า ¹อะตอมไฮโดรเจนตั้งแต่ 1 ถึง 6 ต่างก็มีโครงสร้างข้างเคียง นอกจากนี้ COSY ยังช่วยให้เราเข้าใจความเชื่อมโยงระหว่างอะตอมคาร์บอนทางอ้อมจากข้อมูลการจับคู่ของอะตอมข้างเคียงได้อีกด้วย ¹ข้อมูลนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการกำหนดโครงสร้างย่อย

อย่างไรก็ตาม จะเกิดอะไรขึ้นเมื่อสเปกตรัม COSY มีความซับซ้อนมากดังเช่นในรูปที่ 2?
เมื่อพิจารณาบริเวณที่ไฮไลต์ด้วยสีเขียว คุณจะเห็นว่าสัญญาณต่างๆ ซ้อนทับกัน ทำให้ยากต่อการระบุความสัมพันธ์ ในสถานการณ์เช่นนี้ การดำเนินการต่อไปเพื่อหาโครงสร้างจึงดูเหมือนเป็นไปไม่ได้เลย

สำหรับสารประกอบเช่นพอลิแซ็กคาไรด์หรือโมเลกุลวงแหวน ซึ่ง ¹สัญญาณ H ปรากฏอย่างหนาแน่นในช่วงแคบๆ ดังแสดงในรูปที่ 2 การพึ่งพา COSY เพียงอย่างเดียวอาจนำไปสู่ทางตันในการวิเคราะห์โครงสร้างได้

หนึ่งในวิธีแก้ปัญหาในกรณีที่ COSY วิเคราะห์ได้ไม่เพียงพอ คือ TOCSY
เราจะอธิบาย TOCSY ในหัวข้อถัดไป

TOCSY คืออะไร?

TOCSY (Total Correlation Spectroscopy) เป็นเทคนิค NMR แบบ 2 มิติ ที่ช่วยให้คุณเห็นภาพทุกอย่างได้ ¹อะตอมไฮโดรเจนที่อยู่ในเครือข่ายสปินเดียวกันในเวลาเดียวกัน เนื่องจากแรงคู่ควบสปินแพร่กระจายผ่านเครือข่าย TOCSY จึงไม่เพียงแต่แสดงตำแหน่งที่อยู่ติดกันเท่านั้น แต่ยังแสดงความสัมพันธ์ทั่วทั้งระบบสปิน ทำให้มีประสิทธิภาพสูงในการวิเคราะห์โมเลกุลอินทรีย์ที่ซับซ้อน น้ำตาล และกรดอะมิโน TOCSY ยังเป็นที่รู้จักในชื่อ HOHAHA (HOmonuclear HArtmann-HAhn spectroscopy) ซึ่งโดยพื้นฐานแล้วหมายถึงการทดลองเดียวกัน

ตัวอย่างเช่น สมมติว่ามีการเชื่อมต่ออะตอมดังแสดงในรูปที่ 3 H_A·ชม_B·ชม_C·ชม_D เชื่อมต่อกันผ่านการจับคู่สปินระหว่างเพื่อนบ้าน ¹H และการเชื่อมต่อนี้เรียกว่าระบบสปิน (เครือข่ายสปิน) ระบบสปินจะไม่แพร่กระจายผ่านคาร์บอนควอเทอร์นารีที่ไม่มี H หรือ H ติดอยู่ ¹ไฮโดรเจนเชื่อมต่อผ่านออกซิเจน ดังนั้นเครือข่ายจึงถูกขัดจังหวะ ณ จุดเหล่านี้ TOCSY ช่วยให้เราสังเกตความสัมพันธ์ระหว่างนิวเคลียสภายในระบบสปินเดียวกันได้ แม้ว่าจะไม่ได้เชื่อมต่อกันโดยตรงก็ตาม เช่น ระหว่าง ¹H_A และ ¹H_Dใน TOCSY การถ่ายโอนสนามแม่เหล็กเกิดขึ้นทีละขั้นตอน: จาก H_A ถึง H_Bจากนั้นจาก H_B ถึง H_Cและสุดท้ายจาก H_C ถึง H_Dกล่าวอีกนัยหนึ่งคือ การทำให้เป็นแม่เหล็กเคลื่อนที่ผ่านระบบสปิน เชื่อมโยงทุกสิ่งทุกอย่างที่อยู่ระหว่างทาง การถ่ายโอนการทำให้เป็นแม่เหล็กนี้เรียกว่า "การถ่ายทอด" (relay) เทคนิค TOCSY สังเกตสัญญาณความสัมพันธ์โดยอาศัยการถ่ายทอดนี้

รูปที่ 4 แสดงลำดับพัลส์สำหรับ COSY และ TOCSY COSY ใช้พัลส์ 90° สองตัว ในขณะที่ TOCSY พัลส์ตัวที่สองเป็นพัลส์ล็อคสปิน ระยะเวลาของพัลส์ล็อคสปินนี้เรียกว่า "เวลาผสม" ซึ่งเป็นพารามิเตอร์สำคัญของ TOCSY โดยการเพิ่มเวลาผสม คุณจะสามารถสังเกตสัญญาณความสัมพันธ์ที่ส่งผ่านระยะทางที่ไกลขึ้นภายในระบบสปินได้

เวลาผสมและสัญญาณความสัมพันธ์ของ TOCSY

ภาพที่ 5 แสดงแผนภาพโครงร่างของสเปกตรัม TOCSY ของสารประกอบที่มีเครือข่ายสปินอิสระสองเครือข่าย โดยแต่ละเครือข่ายสปินแสดงด้วยสีเหลืองและสีเขียว ดังที่แสดงไว้ TOCSY สังเกตความสัมพันธ์ของทุกเครือข่าย ¹H ที่เป็นของแต่ละเครือข่ายสปิน ในขณะนั้น หากสัญญาณเช่น "A" และ "a" ภายในสเปกตรัมหลักบนแกนทั้งสองปรากฏขึ้นห่างจากบริเวณที่มีสัญญาณปรากฏหนาแน่น สัญญาณเหล่านั้นจะถูกจำแนกแยกกันได้ง่ายในเครือข่ายสีเหลืองและสีเขียว ทำให้สามารถยืนยันเครือข่ายสปินแต่ละเครือข่ายได้

ต่อไป เรามาดูกันว่าสัญญาณความสัมพันธ์ของ A เปลี่ยนแปลงอย่างไรเมื่อเวลาในการผสมเปลี่ยนไป
ภาพที่ 6 เป็นภาพขยายของความสัมพันธ์ของ A จากแผนภาพ TOCSY ในภาพที่ 5
ด้วยเวลาการผสมที่สั้น การทำให้เป็นแม่เหล็กของ ¹H_A เคลื่อนที่ไปยังบริเวณใกล้เคียงเท่านั้น ¹H_Bและสัญญาณความสัมพันธ์ B กับ ¹H_B ปรากฏ
เมื่อเพิ่มเวลาในการผสมให้มากขึ้น การทำให้เป็นแม่เหล็กจะเคลื่อนไปที่ ¹H_Cและสัญญาณความสัมพันธ์ C ปรากฏขึ้น เมื่อเพิ่มเวลาการผสมให้มากขึ้น การทำให้เป็นแม่เหล็กจะเคลื่อนไปที่ ¹H_Dและสัญญาณความสัมพันธ์ D ปรากฏขึ้น ส่งผลให้เห็นได้ชัดว่ามีความเชื่อมโยงกัน ¹H_A - ¹H_B - ¹H_C - ¹H_D.

ยิ่งใช้เวลาในการผสมนานเท่าไร การกระจายตัวของสนามแม่เหล็กก็จะยิ่งไกลมากขึ้นเท่านั้น ดังนั้น หากใช้เวลาในการผสมนานเพียงพอ สนามแม่เหล็กก็จะสามารถถ่ายทอดไปทั่วทั้งบริเวณได้ ¹H ภายในระบบสปินเดียวกัน ทำให้สามารถตรวจจับสัญญาณความสัมพันธ์ได้สำหรับทุกตัว ¹H ในระบบสปินนั้น
นอกจากนี้ การเปรียบเทียบสเปกตรัมที่ได้จากเวลาการผสมที่แตกต่างกัน ลำดับต่อเนื่องของ ¹นอกจากนี้ยังสามารถทราบการเชื่อมต่อ H ได้อีกด้วย

ตัวอย่างการวิเคราะห์ซูโครสโดยใช้ 2D TOCSY

ในที่นี้ เราจะนำเสนอตัวอย่างการวิเคราะห์ซูโครสโดยใช้ 2D TOCSY ซูโครสเป็นไดแซ็กคาไรด์ที่ประกอบด้วยกลูโคสและฟรุกโตสที่เชื่อมต่อกันด้วยพันธะไกลโคไซด์ ซูโครสมีน้ำตาลทั้งหมด 22 อะตอม ¹Hs แต่เนื่องจากตัวอย่างละลายอยู่ในน้ำหนักเบา ดังนั้น ¹ไม่พบ H ของหมู่ไฮดรอกซิล (-OH) เนื่องจากการแลกเปลี่ยนดิวเทอเรียม ดังนั้นในกรณีนี้ 14 ¹มีการสังเกต H ยกเว้น 8 ¹H ของหมู่ไฮดรอกซิล

มาดูสเปกตรัม COSY ของซูโครสในรูปที่ 7 กันครับ ส่วนที่ไฮไลต์ด้วยกรอบสีแดงนั้นถูกขยายและแสดงในรูปที่ 8

ในรูปที่ 7 สามารถพบสัญญาณความสัมพันธ์หกสัญญาณได้อย่างค่อนข้างง่ายดาย
อย่างไรก็ตาม การตีความความสัมพันธ์ของสัญญาณที่ปรากฏในบริเวณที่ค่าการเปลี่ยนแปลงทางเคมีใกล้เคียงกัน เช่น บริเวณที่แสดงด้วยวงกลมสีแดงในรูปที่ 8 นั้นเป็นเรื่องยาก หลายคนอาจติดอยู่ที่จุดนี้ในการวิเคราะห์
ดังนั้น เราจะลองใช้วิธี TOCSY ดู

รูปที่ 9 สเปกตรัม TOCSY ที่วัดโดยตั้งเวลาผสมไว้ที่ 20 มิลลิวินาที และ 150 มิลลิวินาที

รูปที่ 9 แสดงสเปกตรัม TOCSY ที่วัดได้โดยตั้งเวลาผสมไว้ที่ 20 มิลลิวินาทีและ 150 มิลลิวินาที ตามลำดับ อันดับแรก เราจะพิจารณาสัญญาณความสัมพันธ์ของ ¹H ที่ตำแหน่งอะโนเมอริกของกลูโคส ซึ่งปรากฏที่ค่าการเลื่อนทางเคมีที่ห่างไกลจากสัญญาณอื่นๆ ดังที่แสดงไว้ก่อนหน้านี้ในรูปที่ 6 เราจะตรวจสอบว่าสัญญาณความสัมพันธ์เปลี่ยนแปลงอย่างไรเมื่อเวลาการผสมแตกต่างกัน เพื่อยืนยันข้อมูลการถ่ายทอดจาก ¹H ที่ตำแหน่งอะโนเมอริก นอกจากนี้ยังสังเกตได้ว่าสัญญาณความสัมพันธ์ปรากฏมากขึ้นเมื่อเวลาการผสมเพิ่มขึ้น ยิ่งไปกว่านั้น สำหรับบริเวณที่สัญญาณทับซ้อนกัน การเปรียบเทียบโดยใช้ข้อมูลที่แบ่งเป็นส่วนๆ จะง่ายกว่าการใช้สเปกตรัม 2 มิติ ดังนั้น เราจะเปรียบเทียบสเปกตรัม 1 มิติแต่ละอันที่ได้จากการสกัดส่วนต่างๆ ตามแกน X (ในบริเวณที่ระบุด้วยกรอบสีเขียว) เพื่อยืนยันสัญญาณความสัมพันธ์ของ H ¹H.

สเปกตรัมด้านบนในรูปที่ 10 แสดงถึงแบบดั้งเดิม ¹สเปกตรัม H ด้านล่างเป็นข้อมูลที่ตัดแบ่งแล้วซึ่งได้จากการเปลี่ยนแปลงเวลาการผสมตั้งแต่ 20 มิลลิวินาทีถึง 200 มิลลิวินาที สัญญาณทางด้านซ้ายสอดคล้องกับ Glu H-1 ซึ่งเราถือว่าเป็นจุดเริ่มต้นของการถ่ายทอด ที่เวลาการผสม 20 มิลลิวินาที จะปรากฏเฉพาะความสัมพันธ์กับ Glu H-2 ที่อยู่ใกล้เคียงเท่านั้น ซึ่งเผยให้เห็นเฉพาะการเชื่อมต่อระหว่างตำแหน่งที่ 1 และ 2 เมื่อเวลาการผสมเพิ่มขึ้น สัญญาณความสัมพันธ์จะปรากฏขึ้นตามลำดับ และในที่สุดก็สามารถยืนยันการเชื่อมต่อจากตำแหน่งที่ 1 ไปยังตำแหน่งที่ 6 ในส่วนประกอบของกลูโคสได้ ในขณะที่การระบุคู่ความสัมพันธ์ของ Glu H-5 อย่างชัดเจนโดยใช้ COSY ทำได้ยาก แต่ TOCSY ให้ข้อมูลนี้ได้

ต่อไป เรามาตรวจสอบการถ่ายทอดสัญญาณโดยเริ่มจาก Fru H-3′ กัน
เช่นเดียวกับส่วนประกอบซูโครส รูปที่ 11 แสดงสเปกตรัม TOCSY ที่ได้จากการผสมในเวลาที่แตกต่างกัน

รูปที่ 11. สเปกตรัม TOCSY ที่วัดได้โดยตั้งค่าเวลาผสมไว้ที่ 20 มิลลิวินาที และ 150 มิลลิวินาที

เช่นเดียวกับครั้งก่อน เราเปรียบเทียบข้อมูลที่ตัดตามแนวแกน X เพื่อหาสัญญาณที่ปรากฏในบริเวณที่ไม่ทับซ้อนกันอย่างมีนัยสำคัญ โดยในครั้งนี้จะเน้นไปที่ Fru H-3′

สเปกตรัมด้านบนในรูปที่ 12 แสดงสเปกตรัม ¹H แบบดั้งเดิม และด้านล่างเป็นข้อมูลที่ตัดแบ่งตามช่วงเวลาการผสมที่แตกต่างกัน
เช่นเดียวกับที่ผ่านมา เราใช้ Fru H-3′ เป็นจุดเริ่มต้นของการถ่ายทอดสัญญาณ เมื่อเวลาในการผสมเพิ่มขึ้น ความสัมพันธ์กับ Fru H-4′, Fru H-5′ และ Fru H-6′ จะปรากฏขึ้น ทำให้เราสามารถยืนยันการเชื่อมต่อภายในส่วนประกอบของฟรุกโตสได้

ด้วยวิธีนี้ TOCSY จึงสามารถแยกเครือข่ายสปินภายในสารประกอบที่มีเครือข่ายสปินหลายเครือข่ายได้ นอกจากนี้ การปรับเวลาการผสมยังช่วยให้สามารถประเมินระยะห่างจากจุดเริ่มต้นได้อีกด้วย ¹H. แม้ว่าสเปกตรัม COSY จะมีความซับซ้อน แต่การใช้ TOCSY ก็ยังช่วยได้อย่างมากในการกำหนดโครงสร้างโมเลกุล

ตัวอย่างการวิเคราะห์กลูโคสโดยใช้ 1D TOCSY

1D TOCSY คือเวอร์ชันหนึ่งมิติของ 2D TOCSY โดยมีหลักการพื้นฐานเหมือนกัน
ในขณะที่ 2D TOCSY ใช้ในการวิเคราะห์เครือข่ายสปินของโมเลกุลทั้งหมด 1D TOCSY จะมีประสิทธิภาพมากกว่าเมื่อคุณต้องการตรวจสอบเฉพาะระบบสปินที่โมเลกุลเป้าหมายเชื่อมต่ออยู่ ¹H เป็นส่วนหนึ่งของระบบ 1D TOCSY ซึ่งสังเกตการถ่ายโอนสนามแม่เหล็ก—หรือก็คือการถ่ายทอด—จากสถานะที่ถูกกระตุ้นอย่างเลือกสรร ¹H. โดยการค่อยๆ เพิ่มเวลาในการผสม จะสามารถติดตามการแพร่กระจายของการถ่ายทอดสนามแม่เหล็กไปตามเครือข่ายสปินได้ สำหรับการกระตุ้นแบบเลือกเฉพาะ ควรเลือกค่าที่เหมาะสมที่สุด ¹H ที่มีค่าการเลื่อนทางเคมีแยกออกจากสัญญาณอื่นๆ อย่างชัดเจน
ข้อดีอีกประการหนึ่งของการวัดแบบ 1 มิติ คือ เมื่อเปรียบเทียบกับการวัดแบบ 2 มิติแล้ว การวัดแบบ 1 มิติให้ความละเอียดดิจิทัลที่สูงกว่าและช่วยหลีกเลี่ยงการทับซ้อนของสัญญาณได้ง่ายกว่า

ต่อไปนี้ เราจะนำเสนอตัวอย่างการวิเคราะห์กลูโคส

กลูโคสมีอยู่ในสารละลายในน้ำในรูปของแอนโนเมอร์อัลฟาและเบตา ดังนั้น ¹สเปกตรัม H NMR เป็นสเปกตรัมผสมของ α-กลูโคสและ β-กลูโคส ดังแสดงในรูปที่ 13 สำหรับการกระตุ้นแบบเลือกเฉพาะของ a ¹โดยทั่วไปแล้วสัญญาณ H จะถูกเลือก ¹H ปรากฏที่สนามแม่เหล็กต่ำกว่าตัวอื่นๆ (ในกรณีของน้ำตาล) ¹H ที่ตำแหน่งอะโนเมอริก) ผลลัพธ์จากการทดลอง 1D TOCSY โดยการกระตุ้นอะโนเมอริกแบบเลือกเฉพาะ ¹อะตอม H ที่ตำแหน่งที่ 1 ของ α-กลูโคส แสดงอยู่ในรูปที่ 14

โดยการปรับเวลาการผสมจาก 20 มิลลิวินาทีถึง 200 มิลลิวินาที ทำให้สามารถติดตามเครือข่ายสปินได้โดยเริ่มจากอะโนเมอริก ¹H ที่ตำแหน่ง 1 ของ α-กลูโคสทำหน้าที่เป็นจุดถ่ายทอด สเปกตรัมด้านล่างที่มีเวลาผสม 200 มิลลิวินาที แสดงถึงการแยกเฉพาะเครือข่ายสปินของ α-กลูโคสออกจากสเปกตรัมผสมของ α-กลูโคสและ β-กลูโคส นอกจากนี้ ดังที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 1D TOCSY ให้ความละเอียดดิจิทัลที่ดีกว่าข้อมูลแบบ 2D ที่แบ่งเป็นส่วนๆ
ดังนั้น 1D TOCSY จึงมีประสิทธิภาพมากกว่าในการแยกและยืนยันระบบสปินที่เชื่อมต่อกันผ่านการจับคู่สปินจากสเปกตรัมที่หนาแน่น
แนะนำให้ใช้ 1D TOCSY และ 2D TOCSY ให้เหมาะสมกับวัตถุประสงค์

แอปพลิเคชันที่เกี่ยวข้อง

การแยกสารประกอบฟลูออรีนอินทรีย์ผสมด้วยสเปกโทรสโกปีด้วยวิธี 2 มิติ ¹⁹F-¹⁹F TOCSY -- เพื่อแยกข้อมูล 1 มิติ ¹⁹สเปกตรัม F NMR ของสารประกอบแต่ละชนิด--

ติดต่อเรา

หากคุณสนใจการวิเคราะห์เครือข่ายสปินโดยใช้ TOCSY หรือ HSQC-TOCSY หรือต้องการรายละเอียดเกี่ยวกับเครื่องมือ NMR โปรดติดต่อ JEOL ได้เลย เรามีตัวอย่างการใช้งานมากมายและการสนับสนุนทางเทคนิคที่พร้อมให้การสนับสนุนการวิเคราะห์โครงสร้างโมเลกุลของคุณอย่างเต็มที่

ผลิตภัณฑ์