หลักพื้นฐานของ NOE/NOESY: สาเหตุและวิธีแก้ไขเมื่อไม่ตรวจพบ NOE

NOE (Nuclear Overhauser Effect) เป็นเทคนิคการวัด NMR ที่สำคัญ ซึ่งสามารถเปิดเผยความสัมพันธ์เชิงพื้นที่ภายในโมเลกุลได้ ในคอลัมน์นี้ เราจะอธิบายความแตกต่างระหว่าง NOE, 1D NOESY และ 2D NOESY รวมถึงวิธีการเลือกวิธีการแต่ละวิธี ซึ่งก็คือระยะเวลาผ่อนคลายที่เป็นกุญแจสำคัญในการวิเคราะห์ นอกจากนี้ยังครอบคลุมถึงสาเหตุและแนวทางแก้ไขในกรณีที่ตรวจไม่พบ NOE นอกจากนี้ เราจะตอบคำถามที่พบบ่อยและอธิบายประเด็นสำคัญสำหรับการใช้การวัด NOE อย่างมีประสิทธิภาพ

การวัด NOE คืออะไร?

การวัด NOE (Nuclear Overhauser Effect) เป็นวิธีการสังเกตนิวเคลียสในระยะใกล้ การวัด NOE ถูกนำมาใช้เพื่อวิเคราะห์สเตอริโอเคมีของโมเลกุล แยกแยะไอโซเมอร์ และยืนยันตำแหน่งของหมู่แทนที่ เพื่อนำไปใช้ในการคำนวณสารประกอบโมเลกุลขนาดเล็ก

หลักการของ NOE

NOE เป็นปรากฏการณ์ที่นิวเคลียสที่อยู่ใกล้กันในเชิงพื้นที่ส่งผลกระทบทางแม่เหล็กซึ่งกันและกันและก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงความเข้มของสัญญาณ NMR

เมื่อพิจารณา NOE เราจะนึกถึงโปรตอนสองตัวในโมเลกุลเดียวดังที่แสดงในรูปด้านบน
เมื่อโปรตอนเหล่านี้อยู่ใกล้กัน NOE จะถูกสังเกตเนื่องจากปฏิสัมพันธ์ไดโพล
ในทางกลับกัน หากระยะห่างระหว่างโปรตอนอยู่ห่างไกลกัน NOE จะไม่ได้ถูกสังเกต เนื่องจากไม่มีปฏิสัมพันธ์แบบไดโพล
เป็นที่ทราบกันดีว่าปฏิสัมพันธ์ของไดโพลมีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับระยะห่างระหว่างนิวเคลียสและการเคลื่อนที่ของโมเลกุล และหากระยะห่างระหว่างนิวเคลียสสองตัวสั้นกว่า 6 Å อาจสังเกตเห็น NOE ได้
ในทางกลับกัน เนื่องจากขนาดของปฏิสัมพันธ์นั้นแปรผันตามระยะทางระหว่างนิวเคลียส (r) เทียบกับลบกำลังหก (r-⁶) เมื่อระยะห่างระหว่างนิวเคลียสเพิ่มขึ้น ปฏิสัมพันธ์จะลดลงอย่างรวดเร็ว ทำให้ยากต่อการสังเกต NOE

วิธีการสังเกต NOE

แตกต่างจากการแยกโดยสปินคัปปลิ้ง NOE ไม่ได้ถูกสังเกตด้วยสเปกตรัม NMR (1D, 2D NMR) ที่เราแนะนำไปก่อนหน้านี้
ดังนั้น จำเป็นต้องดำเนินการวัด NOE ดังต่อไปนี้

• การแผ่คลื่นวิทยุไปยังโปรตอนเฉพาะ (การกระตุ้น/ความอิ่มตัว)

• การสังเกตการเปลี่ยนแปลงความเข้มของสัญญาณของโปรตอนอื่น

• กำลังตัดสินว่าการเปลี่ยนแปลงนี้มาจาก NOE หรือไม่

ประเภทของการวัด NOE

การวัด NOE มีอยู่ 3 ประเภทหลักๆ

• ความแตกต่าง NOE: สังเกต NOE สถานะคงที่โดยการวัดความแตกต่างของสเปกตรัมโดยมีและไม่มีการฉายคลื่นวิทยุ

• 2D NOESY: สังเกต NOE ชั่วคราวโดยใช้สเปกตรัม 2 มิติ

• 1D NOESY: กระตุ้นโปรตอนอย่างเลือกสรรและสังเกต NOE ชั่วคราวในมิติเดียว

NOE สถานะคงที่คือการฉายคลื่นวิทยุเป็นเวลานาน ทำให้โปรตอนเฉพาะอิ่มตัว และสังเกตการเปลี่ยนแปลงความเข้มของสัญญาณของโปรตอนอื่นๆ เมื่อสถานะอิ่มตัวคงที่แล้ว
NOE ชั่วคราวจะถูกสังเกตในระหว่างเวลาการผสมหลังจากสถานะการหมุนเปลี่ยนแปลงชั่วคราวโดยการแผ่คลื่นวิทยุช่วงสั้นๆ
เนื่องจากกลไกในการสร้าง NOE นั้นแตกต่างกัน เงื่อนไขการวัดสำหรับแต่ละวิธีจึงต้องได้รับการกำหนดโดยการพิจารณาคุณลักษณะของแต่ละวิธี

การวัดความแตกต่าง NOE

การวัดความแตกต่าง NOE เป็นวิธีการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงความเข้มของสัญญาณของโปรตอนใกล้เคียงโดยการวัดความแตกต่างระหว่างสเปกตรัมของโปรตอนเฉพาะเมื่อได้รับการฉายรังสีด้วยคลื่นวิทยุและเมื่อไม่ได้รับการฉายรังสีด้วยคลื่นวิทยุ

ตามที่แสดงไว้ข้างต้น โปรตอนสองตัว H_I และ H_S จะถูกนำมาพิจารณา H_I และ H_S อยู่ในระยะห่างเชิงพื้นที่ที่ใกล้กันและมีปฏิสัมพันธ์แบบไดโพล
(B) คือ ¹สเปกตรัม H เมื่อ H_S ไม่ได้รับการฉายรังสี

ที่นี่เมื่อคลื่นวิทยุถูกฉายไปที่ H_S เพื่อทำให้ H อิ่มตัว_S, สัญญาณของ H_S กลายเป็นมองไม่เห็น ในเวลานี้ ความเข้มของสัญญาณ H_I มีขนาดใหญ่ขึ้นเนื่องจากปฏิสัมพันธ์ไดโพลระหว่าง H_I และ H_Sนี่คือ "การเปลี่ยนแปลงเนื่องจาก NOE"
เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงความเข้มของสัญญาณโดย NOE มีขนาดเล็กมาก ความแตกต่างระหว่าง (A) และ (B) จึงถูกคำนวณเพื่อให้ความแตกต่างชัดเจน
NOE ที่สังเกตได้จากความแตกต่าง NOE เรียกว่า "NOE สถานะคงที่"
โดยทั่วไป สำหรับสารประกอบโมเลกุลขนาดเล็กที่มีการเคลื่อนที่ของโมเลกุลด้วยความเร็วสูงในสารละลาย เมื่อสัญญาณของโปรตอนที่ถูกฉายรังสีมีการเปลี่ยนแปลงไปทางลง สัญญาณ NOE จะถูกสังเกตเป็นสัญญาณขึ้น ซึ่งเรียกว่า "NOE เชิงบวก"

ตัวอย่างจริงของความแตกต่างในการวัด NOE ถูกนำเสนอโดยใช้เอทิลโครโตเนต

เราต้องการตรวจสอบว่าโครงสร้างของพันธะคู่เป็นซิสหรือทรานส์ โดยใช้การวัดค่าความแตกต่างของ NOE โปรตอนของหมู่เมทิลที่แสดงเป็น A จะถูกฉายรังสี และสังเกต NOE ที่เกี่ยวข้อง

ในส่วนบนของรูปด้านบนนั้น ¹แสดงสเปกตรัม H ของเอทิลโครโตเนต
ในส่วนล่าง แสดงสเปกตรัมความแตกต่างของ NOE เมื่อโปรตอนของกลุ่มเมทิลที่ A อิ่มตัว
ข้อมูลนี้วัดโดยใช้เครื่องมือ 400 MHz และสังเกตสัญญาณ NOE ขึ้นที่ B และ C

จากผลลัพธ์ที่ได้ การฉายรังสีโปรตอนของกลุ่มเมทิลที่ A ทำให้เกิด NOE ที่สังเกตได้ที่ B และ C ซึ่งบ่งชี้ว่าเอทิลโครโทเนตมีโครงสร้างแบบทรานส์

1D NOESY

1D NOESY เป็นวิธีการกระตุ้นโปรตอนเฉพาะเจาะจงและสังเกต NOE ชั่วคราวระหว่างโปรตอนเฉพาะเจาะจงและโปรตอนอื่นๆ ที่อยู่ใกล้เคียงในเชิงพื้นที่เป็นสเปกตรัมมิติเดียว
ในการวัดนี้ จะใช้พัลส์อ่อน (พัลส์แบนด์วิดท์แคบ) และการไล่ระดับสนามพัลส์เพื่อกระตุ้นโปรตอนที่สนใจเท่านั้น และจะบันทึกการเปลี่ยนแปลงของ NOE ในช่วงเวลาการผสม
เนื่องจากไม่จำเป็นต้องลบสเปกตรัมตามความแตกต่างของ NOE จึงได้สเปกตรัมที่วิเคราะห์ได้ง่าย
1D NOESY เหมาะเมื่อคุณมีโปรตอนที่สนใจโดยเฉพาะหรือเมื่อคุณต้องการตรวจสอบ NOE ในวิธีที่ง่ายดาย

ในที่นี้ เราจะนำเสนอตัวอย่างการวัด 1D NOESY โดยใช้เอทิลโครโทเนต (B) ในรูปด้านบนแสดงสเปกตรัม 1D NOESY ที่ได้จากการกระตุ้นโปรตอน A แบบเลือกสรร ขณะที่ (C) แสดงสเปกตรัมที่ได้จากการกระตุ้นโปรตอน C แบบเลือกสรร
ต่างจากสเปกตรัม NOE ที่แตกต่างกัน 1D NOESY จะไม่แสดงสัญญาณที่เหลือที่เกิดจากการลบสเปกตรัมสองสเปกตรัมที่ได้ก่อนและหลังการฉายคลื่นวิทยุ ทำให้วิเคราะห์สเปกตรัมได้ง่ายขึ้น

วิธีการตีความนั้นคล้ายคลึงกับวิธีการตีความ NOE แบบแตกต่าง: เราตรวจสอบว่าสัญญาณอื่นๆ ปรากฏขึ้นอย่างไรเมื่อสัญญาณโปรตอนที่ถูกกระตุ้นอย่างเลือกสรรแสดงลงมา
ในตัวอย่างของเอทิลโครโทเนต เมื่อโปรตอน A ถูกกระตุ้นอย่างเลือกสรร จะสังเกตเห็น NOE ที่เป็นบวกที่ B และ C ในทางกลับกัน เมื่อโปรตอน C ถูกกระตุ้น จะสังเกตเห็น NOE ที่เป็นบวกที่ A เท่านั้น ผลลัพธ์เหล่านี้ยังสนับสนุนการประมาณค่าที่ว่าเอทิลโครโทเนตมีสเตอริโอเคมีแบบทรานส์อีกด้วย
ดังนั้น เมื่อกำหนดสเตอริโอเคมีที่มีการจัดเรียงเชิงพื้นที่ที่คลุมเครือ สิ่งสำคัญคือต้องวัด 1D NOESY ของการกระตุ้นแบบเลือกของแต่ละส่วน

2D NOESY

2D NOESY เป็นวิธีการสังเกตปฏิสัมพันธ์ (NOE) ระหว่างโปรตอนที่อยู่ใกล้กันในโมเลกุลในรูปแบบสเปกตรัมสองมิติ
การทดลองนี้สังเกตลักษณะการเปลี่ยนแปลงของ NOE (NOE ชั่วคราว) ในระหว่างเวลาการผสมหลังจากเปลี่ยนสถานะการหมุนของโปรตอนชั่วคราว
สเปกตรัมที่ได้แสดงสัญญาณของตนเองในแนวทแยงและสัญญาณที่สัมพันธ์กันระหว่างโปรตอนที่อยู่ใกล้กันในเชิงพื้นที่
เนื่องจาก NOESY 2D ช่วยให้สามารถเชื่อมโยง NOE ได้อย่างครอบคลุมในโมเลกุลทั้งหมด จึงเหมาะสำหรับการวิเคราะห์โครงสร้างที่ซับซ้อนและการยืนยันการกำหนดสัญญาณทั้งหมด

จากตรงนี้ เราจะอธิบายวิธีการอ่านสเปกตรัม NOESY แบบ 2 มิติ ดังแสดงในรูปด้านบน เมื่อ A และ C, B และ D อยู่ใกล้กัน สัญญาณสหสัมพันธ์ดังกล่าวจะปรากฏขึ้น
ข้อมูลที่แบ่งตามตำแหน่ง A และ B (ในเส้นประสีน้ำเงิน) ในทิศทางแกน X เทียบเท่ากับสเปกตรัม 1D NOESY โดยการกระตุ้นแบบเลือกของ A และ B ตามลำดับ

รูปนี้แสดง NOESY 2 มิติของเอทิลโครโตเนต
เมื่อดูข้อมูลแต่ละส่วนที่แบ่งส่วน สัญญาณที่ส่วนที่ถูกกระตุ้นอย่างเลือกสรร (สีแดง) จะปรากฏด้านล่าง ในขณะที่สัญญาณที่มีความสัมพันธ์กันของ NOE (สีดำ) จะปรากฏด้านบน (NOE บวก)
เมื่อพิจารณาสัญญาณความสัมพันธ์ที่เป็นสีดำ จะสามารถพบความสัมพันธ์ NOE ดังต่อไปนี้

A：B และ C
บี：เอ
ซี：เอ
ด:อี
อี：ดี

นอกจากนี้ เมื่อเน้นที่ความสัมพันธ์ NOE ระหว่าง A, B และ C ผลลัพธ์ยังสนับสนุนการมีอยู่ของโครงสร้างประเภททรานส์ ซึ่งสอดคล้องกับความแตกต่างที่กล่าวถึงก่อนหน้านี้ระหว่าง NOE และผลลัพธ์ 1D NOESY

แนวทางง่ายๆ ในการเลือกวิธีการวัด NOE

ตามที่เราได้อธิบายไว้ สำหรับการวัด NOE สามารถเลือกวิธีการได้ตามวัตถุประสงค์
เราขอแนะนำให้คุณเริ่มต้นด้วย 1D NOESY ซึ่งช่วยให้ตั้งค่าสภาพได้ง่ายและได้รับสเปกตรัมที่ชัดเจน
-----
ระบุโปรตอนเป้าหมาย: การวัด 1D
ต้องการดู NOE ทั่วโมเลกุลหรือการกำหนดสัญญาณไม่แน่นอน: 2D NOESY
-----

ปัจจัยสำคัญสำหรับการวัด NOE: เวลาผ่อนคลาย

ปัญหาที่น่าหงุดหงิดที่สุดประการหนึ่งในการวัด NOE ก็คือ "เมื่อไม่ตรวจพบสัญญาณ NOE!"
ในกรณีเช่นนี้ โปรดวัดเวลาผ่อนคลายตามยาว (T₁) ของตัวอย่างเป้าหมายก่อน
จากนั้นสำหรับการวัด NOE ที่แตกต่างกัน โปรดตั้งค่าเวลาการฉายรังสีของพัลส์กระตุ้นให้มากกว่า 5 เท่าของ T₁ ของตัวอย่างเป้าหมาย
นอกจากนี้ โปรดตั้งเวลาผสมด้วย 1D/2D-NOESY ไว้ที่ประมาณ 0.8 เท่าของ T₁ ของตัวอย่างเป้าหมาย

แล้วเหตุใดเราจึงต้องพิจารณาเวลาการผ่อนคลายของตัวอย่างเป้าหมายสำหรับการวัด NOE?
เนื่องจาก NOE มีความสัมพันธ์อย่างลึกซึ้งกับเวลาการผ่อนคลาย เนื่องจาก NOE เป็นปรากฏการณ์การผ่อนคลายที่อิงจากปฏิสัมพันธ์ไดโพล

ที่นี่เราอยากจะให้คำอธิบายง่ายๆ เกี่ยวกับการผ่อนคลายใน NMR

ด้านบนเป็นแผนผังแสดงระดับพลังงานของสปินนิวเคลียร์ของจำนวนสปิน = 1/2 เมื่อเป็น
วางไว้ในสนามแม่เหล็กสถิต สปินนิวเคลียร์มีสถานะพลังงานสองสถานะหลังจากผ่านกระบวนการแยกซีแมนโดยได้รับผลกระทบจากสนามแม่เหล็ก
สถานะเสถียรที่มีพลังงานต่ำเรียกว่าสถานะ α ในขณะที่สถานะที่มีพลังงานสูงเรียกว่าสถานะ β
เมื่อคลื่นวิทยุที่มีความถี่เทียบเท่ากับช่องว่างพลังงานนี้ถูกแผ่ออกไป การหมุนในสถานะ α จะดูดซับพลังงานของคลื่นวิทยุและกระตุ้นเข้าสู่สถานะ β
เมื่อจำนวนสปินของสถานะ α และสถานะ β เท่ากันจากการฉายคลื่นวิทยุ การดูดซับพลังงานจะหยุดลง ซึ่งเรียกว่าสถานะอิ่มตัว
ในสถานะอิ่มตัว การหมุนในสถานะเบตาจะปล่อยพลังงานออกมาและกลับสู่สถานะอัลฟา และในที่สุดก็กลับสู่สถานะสมดุลความร้อน กระบวนการทั้งหมดนี้เรียกว่าการผ่อนคลาย
จากนั้นกระบวนการชุดหนึ่งจากการกระตุ้นไปจนถึงการผ่อนคลาย เรียกว่าปรากฏการณ์ NMR ที่เรากำลังสังเกตอยู่

ปฏิกิริยานี้เกิดขึ้นระหว่างสปินนิวเคลียร์สองอันที่อยู่ใกล้เคียงกัน ซึ่งเป็นแรงผลักดันให้เกิดการผ่อนคลายตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ในสารละลาย NMR ปฏิกิริยาไดโพลเป็นหนึ่งในปัจจัยหลักที่ส่งเสริมการผ่อนคลาย ดังนั้น การกำหนดค่าพารามิเตอร์ของเวลาการผ่อนคลายซึ่งมีความสัมพันธ์เชิงลึกกับปฏิกิริยาไดโพลจึงเป็นกุญแจสำคัญสู่ความสำเร็จในการสังเกตการณ์ NOE

สาเหตุและวิธีแก้ไขสัญญาณ NOE ที่ตรวจจับไม่ได้

สาเหตุที่เป็นไปได้และการดำเนินการเมื่อไม่ตรวจพบ NOE มีอธิบายไว้ใน 4 ประเด็นต่อไปนี้

• เพิ่มประสิทธิภาพการปรับตัวอย่าง/เงื่อนไขการวัด

• การเปลี่ยนแปลงการเคลื่อนที่ของโมเลกุล

• เปลี่ยนความถี่เรโซแนนซ์

• การเปลี่ยนวิธีการวัด

ขั้นแรก ตรวจสอบว่า 1. ได้รับการปรับให้เหมาะสมหรือไม่ และหากไม่พบ NOE ให้ลอง 2 ถึง 4

1. ปรับปรุงเงื่อนไขการปรับตัวอย่าง/การวัดให้เหมาะสม

เนื่องจากสัญญาณ NOE อ่อนมาก ผลลัพธ์จึงได้รับผลกระทบอย่างมากจากความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ของตัวอย่าง และการตั้งค่าเงื่อนไขการวัด

• ความเข้มข้น: หากความเข้มข้นสูงเกินไป การผ่อนคลายระหว่างโมเลกุลมีแนวโน้มที่จะเกิดขึ้น ส่งผลให้ NOE อ่อนแอลง

• ข้อควรระวังเกี่ยวกับการปนเปื้อนของสารพาราแมกเนติก: ออกซิเจนที่ละลายและไอออนโลหะ (Fe, Cu, et_C.) ส่งเสริมการผ่อนคลาย จึงป้องกัน NOE ได้

• การตั้งค่าเวลาการฉายรังสี/การผสม: ขึ้นอยู่กับ T₁(เวลาผ่อนคลายตามยาว) เวลาฉายรังสีมากกว่า 5 เท่า เวลาผสมประมาณ 0.8 เท่าเป็นแนวทาง

2. การเปลี่ยนแปลงการเคลื่อนที่ของโมเลกุล

ความเข้มข้นของ NOE ยังขึ้นอยู่กับการเคลื่อนที่ของโมเลกุลด้วย
กราฟต่อไปนี้แสดงให้เห็นความสัมพันธ์ระหว่างความเข้มข้นของ NOE และการเคลื่อนที่ของโมเลกุล

เส้นโค้งนี้ได้รับมาจากการแสดงออกเชิงสัมพันธ์ของความเข้มข้นของ NOE และปฏิสัมพันธ์ไดโพลในเชิงทฤษฎี

แกนตั้งแสดงความเข้มของ NOE ในขณะที่แกนนอนแสดงผลคูณของความถี่การสังเกต ω คูณด้วยเวลาสหสัมพันธ์ของโมเลกุล t_C.
t_C คือเวลาที่โมเลกุลใช้ในการหมุนรอบเต็มรอบในสารละลาย และเป็นพารามิเตอร์ที่แสดงการเคลื่อนที่ของโมเลกุล ซึ่งหมายความว่า ยิ่งโมเลกุลมีขนาดเล็กลง t ก็จะยิ่งสั้นลง_C ยิ่งโมเลกุลมีขนาดใหญ่ขึ้น t ก็ยิ่งยาวขึ้น_C กลายเป็น.

ด้านซ้ายแสดงบริเวณที่มีโมเลกุลต่ำซึ่ง t_C สั้นและโมเลกุลเคลื่อนที่เร็ว ตรงนี้จะสังเกตเห็น NOE ที่เป็นบวก
ในทางกลับกัน ด้านขวาแสดงบริเวณของพอลิเมอร์ที่ t_C มีความยาวและการเคลื่อนที่ของโมเลกุลช้า ในกรณีนี้ จะสังเกตเห็นค่า NOE ที่เป็นลบ ซึ่งหมายความว่ากราฟแสดงให้เห็นว่าความเข้มของ NOE เปลี่ยนแปลงอย่างมากขึ้นอยู่กับการเคลื่อนที่ของโมเลกุล

สิ่งสำคัญในการวัดผลคือต้องมีบางช่วงที่ค่า NOE กลายเป็นศูนย์
เมื่อโมเลกุลอยู่ใกล้กับบริเวณที่ผลคูณของความถี่การสังเกต ω และเวลาสหสัมพันธ์ของโมเลกุล t_C คือ 1. NOE จะอ่อนมากหรือไม่สามารถสังเกตเห็น NOE ได้

ดังนั้น หากไม่สามารถสังเกต NOE ได้ แม้ว่าจะตรวจสอบเงื่อนไขการวัดด้วยเครื่องมือของคุณแล้ว ก็เป็นไปได้ว่าผลคูณของความถี่ในการสังเกต ω และเวลาสหสัมพันธ์ของโมเลกุล t_C อยู่ในภูมิภาคนี้

ในกรณีเช่นนี้ การเปลี่ยน ω หรือ t_C เป็นทางเลือกที่เป็นไปได้
อย่างไรก็ตาม การเปลี่ยน ω หมายถึงการเปลี่ยนแปลงสนามแม่เหล็กในการวัด และอาจเป็นเรื่องยากที่จะลองทำในครั้งเดียวหากคุณถือเครื่องมือเพียงชิ้นเดียว
ดังนั้นเราขอแนะนำให้คุณพิจารณาเปลี่ยน_C ซึ่งก็คือการเปลี่ยนแปลงปัจจัยที่มีผลต่อ_C(การวัดอุณหภูมิและความหนืดของตัวทำละลาย)
เราแนะนำให้คุณเปลี่ยนอุณหภูมิการวัดก่อน

3. เปลี่ยนความถี่เรโซแนนซ์

ต่อไปผมจะอธิบายกรณีที่ความถี่ในการสังเกตเปลี่ยนไป ซึ่งก็คือกรณีที่สนามแม่เหล็กในการวัดเปลี่ยนไป

รูปด้านบนแสดงความสัมพันธ์ระหว่างความเข้มของ NOE และเวลาสหสัมพันธ์ t ของสนามแม่เหล็ก_C แกนตั้งแสดงความเข้มข้นของ NOE ในขณะที่แกนนอนแสดงเวลาสหสัมพันธ์ t_Cเส้นโค้งแต่ละเส้นสอดคล้องกับสนามแม่เหล็กตั้งแต่ 90 MHz ถึง 920 MHz เส้นโค้งจะเลื่อนไปทางซ้ายเมื่อสนามแม่เหล็กที่วัดเพิ่มขึ้น หากเรามุ่งเน้นไปที่ t_C เมื่อค่า NOE กลายเป็นศูนย์ เราจะเห็นได้ว่าจุดที่ความเข้มของสัญญาณกลายเป็นศูนย์นั้นจะเลื่อนไปยังบริเวณที่มีโมเลกุลขนาดเล็ก (ซึ่งโมเลกุลจะเคลื่อนที่เร็ว) เมื่อสนามแม่เหล็กเพิ่มขึ้น
ซึ่งหมายความว่าภายใต้สภาวะการวัดเดียวกัน ความเข้มของสัญญาณของ NOE บวกจะอ่อนลงเมื่อสนามแม่เหล็กสูงขึ้น ตัวอย่างเช่น อาจกล่าวได้ว่าโมเลกุลที่มีค่า NOE เป็นศูนย์ในเครื่องมือวัดความถี่ 600 MHz อาจพบค่า NOE บวกในเครื่องมือวัดความถี่ 300 MHz นอกจากนี้ ในกรณีของโมเลกุลที่มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 1000 มีความเป็นไปได้สูงที่โมเลกุลนั้นจะอยู่ในบริเวณวงกลมที่มี NOE ขนาดเล็กมาก ดังนั้นจึงจำเป็นต้องให้ความสนใจเป็นพิเศษ

4. เปลี่ยนวิธีการวัด

หากไม่พบ NOE หลังจากลองใช้วิธีที่ 1 ถึง 3 ที่แนะนำไปแล้ว จะใช้วิธีการวัดที่เรียกว่า ROESY ซึ่ง ROESY เป็นการวัด NOE ในระบบพิกัดหมุน

รูปด้านบนคือสเปกตรัม 1D NOESY และ 1D ROESY ของ Gramicidin S ที่วัดที่อุณหภูมิ 90°C
ที่อุณหภูมินี้ ค่า NOE ของ Gramicidin S จะเกือบเป็นศูนย์ แต่การใช้ ROESY ช่วยให้สามารถสังเกตสัญญาณสหสัมพันธ์ได้ ค่า NOE ที่สังเกตได้ใน ROESY เรียกว่า ROE ข้อดีที่สุดของ ROESY คือ ดังที่แสดงในแผนภาพ ROE จะเป็นค่าบวกเสมอและไม่มีบริเวณศูนย์
คุณอาจสงสัยว่า "แล้วทำไมไม่ใช้ ROESY ตั้งแต่แรกล่ะ" อย่างไรก็ตาม ROESY จำเป็นต้องมีการตั้งค่าพารามิเตอร์ที่รอบคอบกว่าและมีแนวโน้มที่จะสร้างสัญญาณที่ไม่พึงประสงค์ ดังนั้น ROESY จึงเหมาะสมกว่าเมื่อ NOESY ทำงานได้ไม่ดีนัก

คำถามที่พบบ่อยเกี่ยวกับการวัด NOE

• รูปร่างของสัญญาณ NOE ที่แตกต่างกันดูแปลกๆ!!

  ในการวัดค่า NOE ที่แตกต่างกัน หากไม่ได้กำหนดตำแหน่งการแผ่รังสีไว้ที่จุดสูงสุด อาจเกิดผลกระทบจากสปินคัปปลิ้ง ซึ่งทำให้รูปร่างของสัญญาณเปลี่ยนแปลงไป ดังนั้น ควรกำหนดตำแหน่งการแผ่รังสีให้แม่นยำที่จุดสูงสุด

  

  ในการวัดค่า NOE ที่แตกต่างกัน เมื่อเลือกฉายรังสีแบบมัลติเพลตมากกว่าดับเบิลเพลต และหากตำแหน่งการฉายรังสีเลื่อนจากจุดสูงสุด รูปร่างของสัญญาณจะเปลี่ยนไป สเปกตรัมทั้งสองข้างต้นแสดงผลลัพธ์ของ NOE ที่แตกต่างกันเมื่อโปรตอนหมู่เมทิลของเอทิลโครโทเนตถูกฉายรังสี สัญญาณ NOE ที่เป็นบวกจะสังเกตได้ที่ B และ C หากตำแหน่งการฉายรังสีเลื่อนไปประมาณจุดกึ่งกลางของสัญญาณ A แทนที่จะเป็นจุดสูงสุด จะเกิดสัญญาณขนาดใหญ่ที่ไม่สมมาตรคล้ายเศษตกค้าง ดังแสดงในพื้นที่จุดประของสเปกตรัมด้านบน ซึ่งเกิดจากปฏิกิริยาสปินคัปปลิ้งกับโปรตอน B ควรเลือกตำแหน่งการฉายรังสีที่จุดสูงสุดเสมอในการวัดค่า NOE ที่แตกต่างกัน

• เหตุใดโมเลกุลขนาดเล็กจึงแสดงค่า NOE ที่เป็นลบ

  ปรากฏการณ์นี้เรียกว่าปรากฏการณ์ NOE ทางอ้อม (ปรากฏการณ์สามสปิน) และในโมเลกุลขนาดเล็ก สามารถสังเกตได้เมื่อโปรตอนถูกจัดเรียงเกือบเป็นเส้นตรง

  

  โดยปกติ โมเลกุลขนาดเล็กที่เคลื่อนที่อย่างรวดเร็วในสารละลายจะแสดงสัญญาณ NOE ที่เป็นบวก อย่างไรก็ตาม บางครั้งสัญญาณอาจปรากฏในทิศทางเดียวกันกับ NOE ที่เป็นลบ ตัวอย่างเช่น ลองพิจารณาการจัดเรียงเชิงพื้นที่ที่แสดงในรูปด้านซ้าย ซึ่งโปรตอน AB และ BC อยู่ใกล้กันในเชิงพื้นที่ แต่ AC อยู่ห่างกันมาก รูปด้านขวาแสดงสเปกตรัม 1D NOESY เมื่อโปรตอน A ถูกกระตุ้นอย่างเลือกสรร เนื่องจาก A และ B อยู่ใกล้กัน จึงสังเกตเห็น NOE ที่เป็นบวกที่ B อย่างไรก็ตาม NOE ทางอ้อมอาจปรากฏที่ C ผ่าน B ได้เช่นกัน NOE ทางอ้อมนี้ปรากฏในทิศทางตรงกันข้ามกับ NOE ที่เป็นบวก สิ่งสำคัญคือต้องสังเกตว่าสัญญาณนี้ไม่ได้บ่งชี้ว่า AC อยู่ใกล้กันในเชิงพื้นที่ ปรากฏการณ์นี้มักจะเกิดขึ้นเมื่อโปรตอนทั้งสามถูกจัดเรียงเกือบเป็นเส้นตรงในอวกาศ และเป็นที่รู้จักกันในชื่อ "ปรากฏการณ์สามสปิน"

• เหตุใดจึงไม่สามารถใช้ NOE ได้ แม้ว่าระยะทางควรจะใกล้กันก็ตาม?

  เมื่อโปรตอนสามตัวถูกจัดเรียงในลักษณะพิเศษทางพื้นที่ อาจไม่สังเกตเห็น NOE ได้แม้ว่าจะอยู่ห่างกันก็ตาม

  

  ในกรณีพิเศษของปรากฏการณ์สปินสามประการ ผมจะอธิบายปัญหาสามเหลี่ยม ดังที่แสดงในภาพด้านบน เมื่อโปรตอนสามตัวถูกจัดเรียงในลักษณะพิเศษเชิงพื้นที่ ปัญหานี้อาจเกิดขึ้นได้

  

  เมื่อ A ถูกกระตุ้นแบบเลือกสรร ไม่เพียงแต่ระยะห่างระหว่าง A และ B เท่านั้น แต่ A และ C ก็จะใกล้กันด้วย ดังนั้น คาดว่า NOE ที่เป็นบวกจะมองเห็นได้ระหว่าง A และ C สเปกตรัมที่พยากรณ์ไว้จึงอยู่ทางขวาในรูปด้านบน

  

  อย่างไรก็ตาม NOE เชิงบวกจาก A ถึง C ที่แสดงเป็นสีส้มและ NOE ทางอ้อมผ่าน B ที่แสดงเป็นสีเขียวสามารถหักล้างกันเองได้ ส่งผลให้ไม่มี NOE ที่สังเกตได้
  ในทางทฤษฎี การยกเลิกนี้จะเกิดขึ้นเมื่ออัตราส่วนระยะห่างระหว่างโปรตอนแต่ละคู่เท่ากับ 1:1:1.26 กล่าวอีกนัยหนึ่ง แม้ว่าโปรตอนจะอยู่ใกล้กันในเชิงพื้นที่ ก็อาจไม่สามารถสังเกตเห็น NOE ได้

อ้างอิง

Claridge, DWT(2004), *Yūki kagaku no tame no kōbun Kainou NMR tekunikku* [เทคนิค NMR ความละเอียดสูงสำหรับเคมีอินทรีย์](T.Takeuchi & M. Nishikawa(Trans.) Kodansha Scientific.

Fukushi, E.&Sohmiya H.(2007), *Korenara wakaru nijigen NMR* [การทำความเข้าใจ 2D NMR เป็นเรื่องง่าย] คากาคุ โดจิน.

แอปพลิเคชันที่เกี่ยวข้อง

การสังเกต NOE โดย HSQC-NOESY

ติดต่อเรา

หากคุณสนใจงานวิจัยที่ใช้ NOE หรือต้องการทราบรายละเอียดเกี่ยวกับเครื่องสเปกโตรมิเตอร์ NMR โปรดติดต่อ JEOL ได้เลย เรามีตัวอย่างการใช้งานและการสนับสนุนทางเทคนิคมากมาย เราจึงพร้อมสนับสนุนงานวิจัยของคุณอย่างเต็มที่

ผลิตภัณฑ์